Trypsinizing Siembra y células de mamífero

La tecnología de cultivo de tejidos ha encontrado una amplia aplicación en el campo de la biología celular. Sin embargo, las células cultivadas requieren un mantenimiento regular para mantenerse sanas. A medida que las células alcanzan la cofluidez, deben ser subcultivadas o transitadas.

De lo contrario, se reduce el crecimiento y, finalmente, se produce la muerte celular. En este vídeo, demostramos cómo mantener células de cultivo de tejidos tanto para líneas celulares adherentes como en suspensión. Hola, soy Ricky y estoy en el Laboratorio del Dr. LAN en la Red de Laboratorios de Patología Molecular en el este de Tennessee.

Hoy quiero mostraros dos técnicas para empaquetar células en suspensión y adheridas. Para pasar una placa de Células. Querremos comenzar con un cultivo primario cultivado hasta la fluidez en una placa de Petri de 60 milímetros o un matraz de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados que contenga un medio de cultivo de tejidos de cinco milésimas de pulgada.

Comenzamos eliminando todo el medio del cultivo primario con la pipeta estéril. A continuación, lavamos la monocapa de célula adherida una o dos veces con un pequeño volumen de 37 grados centígrados HBSS sin calcio ni magnesio. Para eliminar cualquier residuo de suero fetal bovino que pueda inhibir la acción de la enzima tripsina que se agregará en el siguiente paso.

A continuación, añada suficiente solución tibia de tripsina EDTA al cultivo para cubrir la capa de células adherentes. Luego, puede colocar el plato en una bandeja calentadora de 37 grados centígrados durante uno o dos minutos. Después de la incubación, golpee la parte inferior de la placa sobre una superficie plana para desalojar las células.

Revise el cultivo con un microscopio invertido para asegurarse de que las células estén redondeadas hacia arriba, lo que indica que están separadas de la superficie. Si las celdas no están lo suficientemente separadas, regrese la placa a la bandeja de calentamiento durante uno o dos minutos adicionales. Después de mirar a través del osciloscopio, enjuague el plato con medio completo y pipetee la suspensión en un tubo cónico de 15 milésimas de pulgada que contenga dos milésimas de pulgada de medio completo.

Gire las celdas hacia abajo para pellet y vuelva a suspender el pellet en medio completo. Ahora, agregue un volumen igual de suspensión celular a cada una de las placas frescas que hayan sido etiquetadas adecuadamente. Alternativamente, las células se pueden contar con un hemocímetro y diluir a la densidad deseada para que se pueda agregar un número específico de células a cada placa.

Asegúrese de etiquetar cada plato con la fecha de la subcultura y el número de paso. Después de agregar la suspensión celular, coloque un milésimo de pulgada de medio fresco en cada nuevo cultivo. Ahora incube las placas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Después de haber incubado las células durante la noche, agregue medio fresco a las placas y vuelva a colocarlas a 37 grados. Una vez que la placa haya crecido hasta alcanzar la fluidez, puede volver a pasar la placa repitiendo este procedimiento y continuar pasando según sea necesario. Ahora te mostraremos cómo pasar células en cultivo en suspensión.

El empaquetamiento de células en cultivo en suspensión es más sencillo que el de las células de adherencia. Antes de empaquetar los cultivos en suspensión, las células deben mantenerse alimentándolas cada dos o tres días hasta que alcancen la cofluidez, que es cuando las células se agrupan en la suspensión y el medio parece turbio. Cuando se agita el matraz.

Para hacer esto, retire el matraz de celdas en suspensión de la incubadora, teniendo cuidado de no molestar a las que se han asentado en el matraz. Coloque el fondo aséptico, retire y deseche aproximadamente un tercio del medio del matraz y reemplácelo con un volumen igual de medio precalentado a 37 grados centígrados. Una vez que haya cambiado el medio, agite el matraz y devuélvalo a la incubadora, que está a 37 grados centígrados, 5% de CO2.

Si hay menos de 15 milésimas de pulgada, un medio en el matraz incuba el matraz en posición horizontal para mejorar el contacto entre la célula y el medio. De lo contrario, el matraz se puede incubar verticalmente en los días en que los cultivos no se están alimentando. Compruébalas girando los planos para resuspender las células.

Asegúrese de observar cualquier cambio de color en el medio que indique un buen crecimiento metabólico. Una vez que los cultivos son confluentes, que deben ser de aproximadamente 2,5 millones de células por mil, puede pasarlos. Una vez más, acabamos de mostrarle cómo pasar células cultivadas tanto para cultivos adherentes como en suspensión.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con todos tus experimentos.