Congelación, descongelación, y las Pilas de embalaje para el transporte
2 de julio de 2008
Cultivos de células de mamíferos se utilizan ampliamente en los estudios de biología celular. Este video describe los conocimientos básicos necesarios para congelar y almacenar las células y la forma de recuperar las poblaciones de congelados.
Los cultivos celulares se utilizan en una amplia variedad de aplicaciones de investigación y diagnóstico. A veces es conveniente almacenar líneas celulares para trabajos futuros con el fin de preservar las células, evitar la senescencia, reducir el riesgo de contaminación y minimizar los efectos de la deriva genética. Las líneas celulares pueden congelarse para su almacenamiento a largo plazo.
En este video, le mostramos cómo congelar células cultivadas tanto en monocapa como en suspensión, y cómo descongelarlas para volver a cultivarlas. Hola, soy Ricky, del laboratorio del Dr. LAN en la Red de Laboratorios de Patología Molecular en el este de Tennessee. Hoy les mostraré cómo congelar células para su almacenamiento a largo plazo y cómo descongelarlas a partir de nitrógeno líquido.
Para congelar células adherentes humanas, comience por levantarlas de la placa como lo haría si las estuviera preparando para su almacenamiento. Tenga en cuenta que es mejor utilizar células que se encuentren en su fase logarítmica de crecimiento para la criopreservación. Una vez que las células se hayan desprendido y haya detenido la reacción de tripsina añadiendo suero o medio que contenga suero, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga estéril y agregue dos mililitros.
Se pueden combinar células en medio completo con suero de tres o más placas procedentes de la misma subcultivo de la misma fuente en un solo tubo. Centrifugar las células durante cinco minutos a 300-350 Gs a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 10 mils a cuatro grados Celsius.
Medio completo, añada un volumen igual de medio de congelación a cuatro grados, mezcle las células completamente y luego coloque el tubo en hielo para contar las células. Utilizando un hemocitómetro, diluya la suspensión con más medio de congelación para obtener una concentración final de células de 1 millón o 10 millones de células por mililitro. Para congelar células de un frasco cuadrado de 25 centímetros casi confluyente, resuspenda en aproximadamente tres mililitros de medio de congelación y pipetee alícuotas de un mililitro de la suspensión celular en viales criogénicos de dos mililitros etiquetados.
Asegúrese de apretar bien las tapas de los viales. Coloque los viales de una hora a toda la noche en un congelador a menos 80, luego transfiéralos a un congelador de almacenamiento en nitrógeno líquido. La congelación de células de cultivo en suspensión es similar en principio a la congelación de células de una monocapa.
La principal diferencia es que los cultivos en suspensión no necesitan ser tratados con tripsina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga y centrifugue durante 10 minutos a 300-350 Gs a temperatura ambiente. A continuación, elimine el sobrenadante y resuspenda el sedimento en medio de congelación a cuatro grados, a una densidad de 1 millón a 10 millones de células por mililitro.
Luego, transfiera alícuotas de un mililitro de la suspensión celular a viales criogénicos y congélelos. Como se hizo con los cultivos en monocapa, que se demostró en el capítulo anterior para descongelar y recuperar los viales congelados. Primero, retire el vial de células del congelador de nitrógeno líquido e inmediatamente colóquelo en un baño de agua a 37 grados.
Agite continuamente el vial hasta que el medio se haya descongelado, lo cual generalmente toma menos de 60 segundos. Una vez descongelado, limpie la parte superior del vial con etanol al 70 % antes de abrirlo. Luego, transfiera la suspensión de células descongeladas a un tubo estéril para centrífuga que contenga dos mililitros de medio completo tibio y suero bovino fetal al 20 %, y centrifugue.
Este paso durante 10 minutos a 150-200 G a temperatura ambiente. Este paso eliminará cualquier DMSO residual tras la centrifugación; deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente el botón celular en una pequeña cantidad, aproximadamente un mililitro, de medio completo con 20 % de FBS, y transfiera esta suspensión a una placa de cultivo debidamente etiquetada que contenga la cantidad adecuada de medio. Por lo general, se necesita un mililitro de suspensión celular en cinco a veinte mililitros de medio.
Ahora, puede colocar las células en un incubador a 37 grados Celsius para su crecimiento después de 24 horas. Deberá asegurarse de que las células se hayan adherido a la placa después de cinco a siete días, o cuando el indicador de pH en el medio cambie de color, momento en el cual deberá cambiar el medio. Deberá mantener los cultivos en un medio que contenga 20 %FBS hasta que la línea celular se haya restablecido.
Si la tasa de recuperación es extremadamente baja, es posible que solo una subpoblación de la cultura original esté creciendo. Tenga especial cuidado con esto al trabajar con líneas celulares conocidas por ser mosaicismo. Si es necesario enviar las culturas, esto se puede hacer fácilmente tanto con cultivos en monocapa como en suspensión.
En matraces de cultivo de tejidos de 25 centímetros, las células se cultivan hasta alcanzar una confluencia casi completa en una monocapa o hasta la densidad deseada en suspensión. Para los cultivos en monocapa, primero se elimina el medio y luego el matraz se llena con medio fresco. Es esencial que el matraz se llene completamente con medio para evitar que las células se sequen si los matraces se invierten durante el transporte.
Para la suspensión, se agrega medio fresco para llenar el matraz. La tapa se aprieta y se asegura en su lugar utilizando parafina. El matraz se sella en una bolsa de plástico hermética u otro recipiente impermeable diseñado para evitar derrames.
En caso de que el matraz resulte dañado, el recipiente primario se coloca entonces en un recipiente aislado secundario para protegerlo de temperaturas extremas durante el transporte. En el exterior del paquete se coloca una etiqueta de peligro para el comprador. Por lo general, los cultivos se transportan mediante mensajería nocturna o en un plazo de entrega de un día hábil.
Acabamos de mostrarle cómo congelar y descongelar cultivos celulares humanos, tanto para células adherentes como en suspensión. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con todos sus experimentos.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este video demuestra las técnicas esenciales para congelar y almacenar células de mamífero cultivadas, así como para recuperarlas a partir de stocks congelados. El almacenamiento adecuado de células es crucial para preservar líneas celulares para investigaciones futuras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Técnicas de cultivo celular
- Preservación celular
Antecedentes
- Las células de mamífero cultivadas se utilizan ampliamente en la investigación.
- La congelación de células ayuda a evitar la senescencia y la contaminación.
- El almacenamiento a largo plazo de líneas celulares es esencial para experimentos futuros.
- Las técnicas de descongelación son necesarias para reanimar células congeladas.
Objetivo del estudio
- Demostrar el proceso de congelación de células para almacenamiento a largo plazo.
- Explicar cómo descongelar células congeladas para su posterior crecimiento.
- Proporcionar habilidades prácticas para investigadores que trabajan con cultivos celulares.
Métodos Utilizados
- Congelación de células cultivadas en monocapa y en suspensión.
- Uso de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
- Procedimientos de descongelación para recuperar células congeladas.
- Demuestra técnicas en un entorno de laboratorio.
Resultados principales
- Conseguir la congelación y el almacenamiento exitosos de células de mamífero.
- Técnicas efectivas de descongelación demostradas.
- Preservación de la viabilidad celular tras el descongelamiento.
- Orientación sobre cómo evitar errores comunes en el almacenamiento de células.
Conclusiones
- Las técnicas de congelación y descongelación son fundamentales para el trabajo con cultivos celulares.
- Los métodos adecuados pueden mejorar la longevidad de las líneas celulares.
- Estas habilidades son esenciales para los investigadores en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preservación y recuperación confiables de células son fundamentales para mantener modelos preclínicos consistentes y garantizar la reproducibilidad en los flujos de trabajo de validación de dianas y desarrollo de ensayos. La criopreservación adecuada minimiza la deriva genética y los riesgos de contaminación, favoreciendo la integridad a largo plazo de las líneas celulares en la investigación traslacional. Estas técnicas permiten obtener células de manera estandarizada y escalable en las etapas de descubrimiento y preclínica, reduciendo la variabilidad en estudios mecanicistas y en los esfuerzos de identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la preservación de líneas celulares genéticamente estables para un análisis consistente de la interacción con el blanco y de las vías metabólicas.
- Valor operativo: Reduce la necesidad de subcultivos frecuentes, minimizando la deriva fenotípica y la variabilidad experimental.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona reservas de células renovables y de bajo número de pasajes para ensayos de cribado de alto rendimiento y calificación de ensayos reproducibles.
- Valor operativo: Apoya la consistencia entre lotes en ensayos celulares, mejorando la fiabilidad de los datos a lo largo de las campañas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Garantiza la continuidad de modelos celulares relevantes para enfermedades desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Valor operativo: Facilita la distribución estandarizada de células entre equipos y sitios, favoreciendo la colaboración multifuncional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
La criopreservación celular se integra en el continuo del descubrimiento al permitir el abastecimiento confiable de células para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y las pruebas preclínicas, asegurando la consistencia del modelo en todas las etapas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el suministro de líneas celulares estables y bien caracterizadas para la validación de dianas y la elucidación de vías.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante bancos celulares estandarizados y libres de contaminación, adecuados para la selección reproducible de compuestos.
- Análisis: Genera entradas celulares cuantificables y consistentes que aumentan la confianza en los resultados de respuesta a la dosis y viabilidad.
- Investigación Traducional: Mantiene la fidelidad del modelo desde el descubrimiento inicial hasta los estudios preclínicos, reduciendo el riesgo biológico en el avance de candidatos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad centralizada y reutilizable de bancos celulares que estandariza el abastecimiento celular entre proyectos y regiones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al minimizar la deriva genética y garantizar la consistencia fenotípica en ensayos basados en células.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante protocolos estandarizados de congelación, descongelación y envasado.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo de fracaso en fases avanzadas al asegurar modelos preclínicos confiables y resultados biológicos consistentes.
- Impacto en la cartera: Permite la toma de decisiones ajustada al riesgo al proporcionar sistemas celulares fiables para la validación de dianas y la optimización de compuestos líderes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas asépticas y manejo de crioprotectores para mantener la viabilidad celular.
- Depende del acceso a equipos de congelación con tasa controlada y a infraestructura de almacenamiento en nitrógeno líquido.
- Necesita procedimientos operativos estandarizados entre los equipos para garantizar tasas consistentes de recuperación celular.
- Requiere adaptación del medio de congelación y de la densidad celular según el tipo de célula y sus características de crecimiento.
- Limitado por la sensibilidad de las líneas celulares a los crioprotectores y al estrés por congelación-descongelación, lo cual puede afectar la eficiencia de recuperación.
