Name: Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a cultivar células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea de ratón. Este método permite analizar la proliferación, morfología y maduración celular mediante citometría de flujo para estudios inmunológicos.

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JB es apoyado por becas de de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC). Apoyo a este proyecto ha sido proporcionada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, Grant MOP-67066.

Este protocolo ha sido adaptado de Lutz et al 1. Cosecha y el procesamiento de la médula ósea <ol><li> El aislamiento de la tibia y el fémur: la eutanasia de los donantes del ratón y el spray de las piernas con el 70% de etanol. Sujete el tobillo primera firmemente con unas pinzas romas y empezar a cortar la piel y la musculatura subyacente para exponer la tibia. Para evitar daños en el hueso, corte lento y paralelo a la tibia, dejando intacta la articulación de la rodilla. Para limpiar el fémur, inmovilizar la articulación de la rodilla sujetándolo con unas pinzas romas. Limpie la musculatura con un par de tijeras afiladas y pinzas curvas. Continuar hacia arriba hasta la articulación de la cadera se expone y las tijeras se puede colocar entre la cabeza del fémur y la articulación de la cadera. Quitar los huesos por conjuntos de corte entre el fémur y la cadera y el lugar en tampón fosfato salino (PBS) en el hielo. </li><li> Extracción de médula ósea: Limpiar la musculatura restante de los huesos con tijeras y pinzas curvas. Cortar las epífisis de cada hueso y localizar la cavidad central. Con una jeringa de 10 ml cargada con PBS y una aguja 25G0.5 &quot;, al ras de la médula ósea en un plato recubierto de tejido de Petri. </li><li> Procesamiento de médula ósea: Use la punta de goma del émbolo de una jeringa de 1 ml de disociar la médula ósea a una suspensión de una sola célula (el uso de arriba hacia abajo, no raspar el movimiento). Recoger la médula ósea en un tubo cónico de halcón, y aclarar la médula ósea residual con PBS. </li></ol> Cultivo de células dendríticas <ol><li> Resuspender las células en los medios de comunicación de CC y precursores contar DC en un hemocitómetro (Figura 1). Usted verá las células de diferentes tamaños, los precursores de DC son los más grandes y más brillantes. Diferencialmente contar sólo estas células. A partir de dos fémures y dos tibias de un tipo salvaje C57Bl / 6 ratones (6-8 semanas), usted debe esperar entre 25 a 40 x 10 6 precursores DC total. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figura 1 </li><li> Las células de cultivo a una densidad de 2 x 10 5 precursores DC / mL en los medios de comunicación DC complementado con 40 ng / ml recombinante murino GM-CSF. Células de la placa de no tejidos recubiertos con placas de poliestireno de Petri. </li></ol> Añadir los medios de comunicación (día 3) Para actualizar los medios de comunicación, agregar la mitad del volumen total de medio fresco suplementado con 40 ng / ml de GM-CSF. Vuelva a colocar una tercera parte de los medios de comunicación (día 6) y la maduración Para actualizar los medios de comunicación, retire con cuidado la tercera parte del volumen total de los medios de comunicación y sustituir este volumen con nuevos medios de comunicación DC complementado con 40 ng / ml de GM-CSF en el día 6 de la cultura. Si lo desea, las células dendríticas pueden ser estimuladas para la maduración con citoquinas o peaje-como los ligandos del receptor. En el video, los países en desarrollo fueron madurados por la estimulación durante la noche con 5 ng / mL CpG. La cosecha de las células dendríticas DC la cultura es completa (Figura 2). Las células serán tanto en la suspensión y libremente adherido a la placa. Células adheridas se puede quitar raspando el plato con un raspador de cultivo de tejidos y lavar con PBS. El número total de células aumentará 8.5 veces durante el cultivo de una semana y el período de diferenciación, por lo tanto, esperamos cosechar 1-1,6 x 10 6 células / ml. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figura 2" width="407" height="358" /> Figura 2 Reactivos <ol><li> DC los medios de comunicación <ol><li> RPMI-1640 suplementado con: </li><li> 10% de suero fetal bovino </li><li> 100 UI / ml de penicilina </li><li> 100 mg / ml de estreptomicina </li><li> 1% de L-glutamina </li><li> 0,1% 2-mercaptoetanol </li><li> 1X no aminoácidos esenciales </li><li> 1X sodio piruvato </li></ol></li><li> Recombinante murino GM-CSF <ol><li> rmgm-CSF (Peprotech inc, New Jersey, no hay ningún catálogo. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

Los países en desarrollo son útiles para estudios de interacciones inmune innato y adaptativo, y puede ser empleado como un vector de la vacuna. En este video, que han demostrado los pasos para aislar la médula ósea y diferenciar células dendríticas mieloides in vitro. Tras el período de cultivo, estas células se pueden visualizar al microscopio las células tanto como adherentes, que a menudo poseen las dendritas, y las células no adherentes y vuelta. Los países en desarrollo puede ser manipulado para la presentación de antígenos por pulsac...

<table><tbody><tr><td>GM-CSF murino recombinante</td><td>Reactivo</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Células dendríticas mieloides (DC) se utilizan con frecuencia para estudiar las interacciones entre los mecanismos de inmunidad innata y adaptativa y la respuesta temprana a la infección. Debido a que estos son los antígenos más potentes células presentadoras de los países en desarrollo se están utilizando cada vez más como un vector de la vacuna para estudiar la inducción de antígenos específicos de la respuesta inmune. En este vídeo, que muestran el procedimiento para la recolección de la tibia y el fémur de un ratón de los donantes, el procesamiento de la médula ósea y la diferenciación de los países en desarrollo in vitro. Las propiedades de cambio los países en desarrollo después de la estimulación: las células dendríticas inmaduras son fagocitos potentes, mientras que los países en desarrollo maduros son capaces de presentación del antígeno y la interacción con CD4 + y CD8 + T. Este cambio en la actividad funcional se corresponde con la regulación al alza de los marcadores de superficie celular y la producción de citoquinas. Muchos de estos agentes puede ser usado para los países en desarrollo maduro, incluyendo citoquinas y peaje-como los ligandos del receptor. En este vídeo, que muestran las comparaciones de citometría de flujo de la expresión de dos moléculas co-estimulantes, CD86 y CD40, y la citoquina, la IL-12, tras la estimulación durante la noche con el tratamiento con CpG o simuladas. Después de la diferenciación, países en desarrollo puede ser manipulado para su uso como vector de la vacuna o para generar antígenos específicos de la respuesta inmune in vitro de pulso con péptidos o proteínas, o transducidas con vectores virales recombinantes.

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

Las células dendríticas (CD) mieloides se utilizan frecuentemente para estudiar las interacciones entre los mecanismos inmunitarios innatos y adaptativos, así como la respuesta temprana a...

Me llamo Jeanette Boudreaux, y hoy me gustaría mostrarles los pasos para cultivar células dendríticas mieloides mediante el método de reflejo a partir de precursores de médula ósea. La línea celular de DC mieloides está adquiriendo cada vez mayor relevancia en los estudios sobre la interacción entre inmunidad innata y adaptativa, además de utilizarse cada vez más como plataforma para el desarrollo de vacunas. Hoy les explicaremos los pasos para aislar las células precursoras, colocarlas en cultivo y diferenciarlas en células dendríticas.A continuación, les mostraré un análisis por citometría de flujo de las células antes y después de la maduración. Con el ligando del receptor tipo toll, las células proliferan in vitro durante el período de cultivo, por lo que se espera observar un aumento de cinco a ocho veces en el número total de células en comparación con los precursores que sembraron el día cero. Los procedimientos que les mostraré hoy se demostrarán sobre una mesa de laboratorio abierta, pero para mantener la esterilidad, recomiendo realizar sus cultivos en una cabina de seguridad biológica o en una campana de flujo laminar.Para comenzar, necesitará una jeringa de 10 ml con un

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video describe un protocolo para la generación de células dendríticas--células presentadoras de antígenos clave que activan las células T-- a partir de la médula ósea de un ratón adulto.

Generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea: un método para generar células dendríticas a partir de médula ósea de ratón

Este video muestra un ensayo in vitro para generar células dendríticas plasmocitoides (pDCs) a partir de células progenitoras linfoides comunes (CLPs). Al cocultivar CLPs purificadas con células alimentadoras irradiadas con γ en presencia de ligando (FL) de tirosina quinasa-3 similar a Fms, las CLP se diferencian en pDC no adherentes, cuya presencia se confirma mediante citometría de flujo.

Generación in vitro de células dendríticas plasmocitoides a partir de progenitores linfoides comunes

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprenda a cultivar células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea de ratón. Este método permite analizar la proliferación, morfología y maduración celular mediante citometría de flujo para estudios inmunológicos.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

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