De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

Hoy les mostraré cómo preparar cortes de retina del ajolote tigre para grabaciones mediante el método de "patch clamp". Primero, prepararé dos tipos de portaobjetos. Utilizamos portaobjetos que tienen un pozo adhesivo unido a ellos para poder usarlos como cámaras de fluido.

En el primer portaobjetos, coloco dos bandas paralelas de grasa al vacío. Luego tomo un papel de filtro y lo corto en piezas rectangulares con una elevación de luz. Ahora coloco una de las piezas sobre los rieles de grasa y la presiono hacia abajo para que quede bien adherida al portaobjetos.

Hago lo mismo con la otra pieza. El segundo tipo de portaobjetos tiene pequeños bloques de goma pegados a él. Por ahora, solo añado un poco de grasa para vacío entre los bloques; también coloco una pieza nueva de hoja de afeitar en el cortador de tejidos.

Finalmente, preparo las herramientas que necesitaré durante la disección, que son dos pares de pinzas, un par de tijeras y una herramienta para extraer el ojo de la cabeza con el fin de registrar las corrientes inducidas por la luz. La disección debe realizarse bajo luz infrarroja, pero con fines demostrativos, ahora trabajaré a la luz visible. Primero retiro el ojo y lo coloco bajo el microscopio sobre un trozo de papel de filtro, que humedecí con solución de Ringer fría con hielo.

Luego retiro el tejido conectivo adicional del globo ocular para asegurarme de que no dañe el ojo. Siempre corto a lo largo de la superficie. Esto es lo que se observa a través del microscopio.

A continuación, utilizo una cuchilla de afeitar para hacer una pequeña incisión en la córnea. Para ello, sujeto el ojo con la pinza mientras presiono el borde de la cuchilla contra la córnea. Luego sostengo la córnea con la pinza mientras la retiro con las tijeras para extraer el cristalino.

Aplico algo de presión sobre los bordes de la copa ocular para poder acceder fácilmente al cristalino con la pinza. A continuación, retiro el iris. Sujeto el iris con la pinza mientras corto a lo largo de la aurora serata hasta que solo queda la copa ocular.

Luego corto la taza I en dos piezas rectangulares. Primero la corto por la mitad y después recorto los bordes superior e inferior. Ahora tomo uno de los portaobjetos que preparé anteriormente, tomo una pieza de la taza I y la coloco con el lado de la retina hacia abajo sobre el papel filtro.

Luego levanto esta esclerótica para que solo permanezca la retina sobre el portaobjetos. Después, agrego rápidamente nuestra solución alrededor de la cámara. Repitamos el procedimiento para el segundo fragmento de retina.

Pero esta vez puede observar a través del microscopio mientras coloca la retina sobre el papel filtro. Utilizo la pinza con la mano izquierda para presionar cuidadosamente la esclerótica. Finalmente, corto la retina en rebanadas de 200 a 300 micrómetros de ancho.

A continuación, elijo un corte para usar en mis experimentos. Para seleccionar un buen corte, necesito rotar los cortes 90 grados para poder observar las capas de la retina. Elijo un corte que parezca intacto y que muestre bandas horizontales bien definidas que indiquen las diferentes capas.

Para mover las laminillas de una a otra, creo un puente de Ringer y luego muevo cuidadosamente las laminillas a través de la solución. Cuando coloco la sección, la presiono contra los bloques de goma para que el papel de filtro quede orientado verticalmente respecto al vidrio. Ahora estoy listo para realizar el registro mediante parche y fijación.

Almacenamos la solución intracelular en pequeñas porciones en el congelador para que solo descongelemos la cantidad que realmente necesitamos en un día. Antes de llenar los electrodos, filtramos la solución para eliminar partículas pequeñas que podrían obstruir la punta del electrodo. Los electrodos de registro se elaboran a partir de vidrio capilar de borosilicato para registrar de células ganglionares.

Eligo una configuración de succión que produzca resistencias del electrodo entre dos y cuatro megaohmios. Al llenar los electrodos, quiero asegurarme de que no haya burbujas de aire en la punta del electrodo. Dar golpecitos suaves al vidrio con el dedo ayuda a eliminar las burbujas.

Este es el soporte del electrodo conectado al cabezal. El rodillo electro contiene un alambre de cloruro de plata. Este es el electrodo de tierra con un puente niga.

Aquí está la pipeta de perfusión. Está conectada a un sistema de microperfusión de ocho canales. La perfusión principal se realiza por gravedad, por lo que consiste simplemente en una botella llena con wingers, y la solución fluye a través de este tubo hacia la cámara de registro.

Para poder grabar en la oscuridad, tengo una cámara de infrarrojos conectada al puerto lateral del microscopio, la cual está conectada a una pantalla de televisión. En el puerto superior, conecté un proyector de imágenes, que me permite proyectar estímulos visuales sobre la retina. Y finalmente, el amplificador de registro por parche.

Ahora coloco el corte retiniano bajo el microscopio y añado el electrodo de tierra al baño para establecer la perfusión principal. A continuación, añado el tubo del sistema de perfusión por gravedad. El tubo de vidrio en el otro extremo está conectado a una succión al vacío, lo que mantiene constante el nivel de líquido.

También me aseguro de que un tubo de succión esté conectado al hombro electro. A continuación, posiciono la pipeta de microperfusión. La bajo en el baño, siguiendo con el objetivo del microscopio.

Una vez que me acerco a la sección, la retrocedo un poco para que la solución impacte sobre ella. Cuando enciendo la perfusión, debería ver que la sección se mueve ligeramente, como aquí. Busquemos ahora una buena célula de la cual registrar.

Estamos buscando células ganglionares, que se encuentran en la parte inferior del corte. Ahora preparo el electrodo antes de introducirlo en el baño; añado algo de presión positiva. Una vez que localizo el electrodo bajo el microscopio, lo bajo hasta situarlo justo encima del corte para realizar el sellado sobre una célula.

Cambié al objetivo de 40x. Ahora pongo a cero la corriente de línea base y verifico la resistencia del electrodo. La prueba de sellado consiste en una secuencia de pulsos de 10 milivoltios, lo que me permite comprobar si he establecido un sello hermético entre el electrodo y la célula.

Ahora bajo mi electrodo sobre la célula diana. Una vez que veo un pequeño hundimiento en el cuerpo celular, libero la presión positiva del tubo, lo que establece un sello apretado. La resistencia es ahora tan alta que el trazo de la corriente parece plano.

Las pequeñas puntas son artefactos de capacitancia del electrodo. Estos pueden compensarse de esta manera, así que ahora han desaparecido. Ahora intentaré penetrar en la célula.

Para hacer eso, apliqué con cuidado pequeñas pulsaciones de succión en el tubo conectado al hombro del electrodo, y si todo funciona correctamente, se observa un cambio en el trazado de la corriente como este. Los picos que ahora se pueden ver están atravesados por la capacitancia de la membrana y también se pueden compensar. Esta es una preparación que se realizó en la oscuridad. Veamos si podemos registrar respuestas evocadas por la luz.

El trazo que puede observarse en el osciloscopio es la respuesta de corriente de una célula ganglionar sujeta a un clampaje de voltaje a menos 60 milivoltios. Los estímulos luminosos que utilizamos son barras brillantes y oscuras presentadas sobre un fondo uniforme constante. El software de nuestro laboratorio muestra el registro completo de un ensayo.

Se puede observar que esta es una célula OFF debido a su respuesta al inicio de una barra oscura y a la finalización de una barra brillante. La línea blanca en la parte superior indica la duración del estímulo. Ahora podemos realizar experimentos en los que perfundimos diferentes agentes farmacológicos.

Por ejemplo, podemos bloquear la inhibición sinérgica GABAérgica y glicinérgica. Después de esperar menos de un minuto, por lo general podemos comenzar a observar aquí los efectos del fármaco. La respuesta se volvió más intensa y prolongada.

La preparación de cortes retinianos se ha utilizado ampliamente para registrar las corrientes sinápticas de diferentes células en la retina, y si se añade un colorante fluorescente a la solución del electrodo, el tipo de célula puede confirmarse fácilmente. Anatómicamente, aquí utilizamos la salamandra TGA larval como modelo animal. El hecho de que las salamandras sean animales de sangre fría y tengan células retinianas grandes proporciona condiciones de grabación ventajosas, pero la misma técnica puede aplicarse a preparaciones de mamíferos.