Name: De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de retina de salamandra tigre para grabaciones de patch clamp. Este método permite estudiar respuestas sinápticas excitatorias evocadas por luz en neurociencia visual.

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Soluciones <ul><li> Solución intracelular de las células ganglionares (en mM): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH </li><li> Solución intracelular de las células bipolares (en mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM sulforodamina B (para la tinción), ajustada a pH = 7,4 con KOH </li><li> Ringer extracelular de solución (en mM): 112 NaCl, 5 de glucosa, HEPES 5, 2 KCl, CaCl2 2, 1 MgCl 2, ajustada a pH = 7,75 con NaOH. La oxigenación de la solución, no es necesario. </li></ul> Prepare las cámaras de grabación Nuestra cámara de registro consiste en un portaobjetos de microscopio con un adhesivo y en el que pequeños bloques de silicona cortada de otro adhesivo y se colocan para dar estabilidad a las secciones de tejidos. Preparación de rodajas de retina Para evitar la decoloración de los fotorreceptores, la disección se lleva a cabo a la luz tenue luz infrarroja o roja. Si uno está interesado en registrar las respuestas de la vía de la barra, sólo la luz infrarroja se debe utilizar (IR microscopio de disección y sin luz de la habitación. Adicionales gafas de IR se debe utilizar para los procedimientos no se realiza bajo el microscopio). Si uno está interesado principalmente en el registro de respuesta de los conos de luz, con poca luz ambiente de color rojo o una linterna de color rojo se puede utilizar. El microscopio, sin embargo, todavía debe tener oculares IR. Si la entrada de los fotorreceptores es irrelevante para el experimento, los procedimientos pueden llevarse a cabo a la luz normal de la habitación utilizando un microscopio normal. <ol><li> Prepare dos portaobjetos con un adhesivo de silicona, así: crear dos bandas paralelas de grasa de silicona (alrededor de 0,5 cm de distancia) en cada diapositiva y colocar un trozo rectangular de papel de filtro en un lado de la diapositiva, cruzando las dos bandas de grasa (empuje el filtro papel con parte de una hoja de afeitar para que se agarra bien a la diapositiva) </li><li> Sacrificio de una salamandra de acuerdo a los protocolos establecidos: el animal se coloca en un baño de hielo durante 30 minutos, y luego decapitado y doble pithed. </li><li> Eliminar los ojos de la cabeza de salamandra y lo coloca bajo la lupa en un pañuelo de papel humedecido con una solución helada de Ringer </li><li> Eliminar el tejido conjuntivo del ojo </li><li> Use una hoja de afeitar para hacer una pequeña incisión en la córnea </li><li> Mantenga cortar la córnea con una pinza mientras se retira con unas tijeras a lo largo de su adhesión a los ojos </li><li> Retire el objetivo con fórceps </li><li> Sostenga el iris con una pinza y corte a lo largo de la ora serrata para eliminar el iris </li><li> Cortar el ocular en dos piezas rectangulares </li><li> Recoger una de las piezas y el lugar que parte esclerótica hasta en el papel de filtro (asegúrate de que para aplanar la pieza, mientras que empuja hacia abajo con mucho cuidado) </li><li> Con cuidado, levante la esclerótica en la retina, que ahora deberá adjuntarse al documento de servidor de archivos </li><li> Añadir rápidamente una solución helada de Ringer para el bienestar </li><li> Repita lo mismo con la segunda pieza </li><li> Use una hoja de afeitar colocado en una máquina de cortar por encargo de cortar 200-300μm rebanadas de ancho. </li><li> Use un par de pinzas para recoger las rebanadas en el lado del papel de filtro, darles la vuelta para las capas de la retina se hacen visibles, y colocarlos en las bandas de grasa de vacío </li><li> Escoja un sector que se ve en buen estado y muestra las bandas horizontales que indican las capas de la retina (las capas son a veces difíciles de ver bajo el microscopio de disección como la ampliación no es suficiente, sin embargo, si se puede reconocer algunas capas de la rebanada es generalmente suficiente. La decisión final sobre si se debe usar el corte, sin embargo, se hace una vez que se observa bajo el microscopio en posición vertical). Mover a la cámara de registro de diapositivas mediante la construcción de un puente de timbre entre las dos diapositivas </li><li> Asegúrese de que el papel de filtro es empujado contra los bloques de caucho en la cámara de grabación, por lo que el sector no está inclinado (células ganglionares y los fotorreceptores se debe enfocar en, al mismo tiempo) </li></ol> Colocar el tejido en el equipo de grabación <ol><li> La diapositiva de grabación se coloca bajo el microscopio y perfundidos con Ringer a través de una perfusión syste gravedad </li><li> La preparación se visualiza con un microscopio vertical, con un objetivo de inmersión en agua 10x y 40x. </li><li> Una vez más, sólo usamos luz infrarroja para prevenir la decoloración de los fotorreceptores. Una cámara de infrarrojos se conecta al puerto lateral del microscopio, que está conectado a una pantalla de televisión. </li></ol> La estimulación visual Los estímulos visuales son programadas en Matlab utilizando el Psychtoolbox y se proyectan en la retina a través del puerto de la parte superior del microscopio utilizando una imagen de microscopía de inyector (MBF biociencias). A Bits + + procesador de vídeo digital (Cambridge Research Systems) se utiliza para obtener una escala de luminosidad de 14 bits y Synchronize la presentación del estímulo a la adquisición de datos. Los estímulos visuales que se utilizan en este video son las barras brillantes u oscuros (width = 460μm) del 100% de contraste, que se presentaron durante dos segundos sobre un fondo uniforme, constante (luminancia = 8 * 10 4 fotones / m / s, tamaño: 1,84 x 1.38mm). Electrofisiología <ul><li> Electrodos de parche se tira de vidrio de borosilicato (OD:.. Identificación de 1,5 mm, 84 mm) con un extractor de micropipeta. De las células ganglionares, las resistencias se sitúan entre 2 y 4 MOhms. De las células bipolares, el aumento de las resistencias entre 4 y 8 MOhms se utilizan. </li><li> Grabaciones de pinza de voltaje se realizan con un 700A MultiClamp (Molecular Devices), un amplificador y software de laboratorio interno programado en Labview. </li><li> Las drogas son perfundidos a través de un sistema de perfusión de 8 canales. El electrodo microperfusión se coloca cerca de la corte (el tejido visiblemente debe moverse cuando se enciende la perfusión dentro y fuera, pero hay que tener cuidado de que la presión no es demasiado fuerte para que el sector podría desprenderse del papel de filtro). Durante los experimentos microperfusión debe estar constantemente encendido (solución de control de la perfusión de drogas si no son necesarios) para que la grabación no se inquiete por el cambio de la perfusión de encendido y apagado. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Beneficios: <ol><li> Todos los tipos de células son accesibles </li><li> Fácil identificación de los tipos de células, en particular si un tinte fluorescente se añade a la solución de electrodos </li><li> Agentes farmacológicos pueden llegar fácilmente a las células diana </li><li> La técnica de patch clamp permite investigar el papel de los diferentes canales iónicos en los cálculos de la retina. La misma información no se puede obtener a través de grabaciones extracelulares pico o grabaciones con electrodos afilados....

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Amplificador de parche de membrana</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Micróscopio de disección</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Micróscopio vertical</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Equipado con objetivos de inmersión en agua de 40x y 10x, filtros fluorescentes y lámpara de mercurio</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Inyector de imagen para microscopio</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión de 8 canales</td><td>Microperfusión</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Procesador de video digital</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oculares infrarrojos</td><td>Otros</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipiente adhesivo de silicona</td><td>Otros</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>20 mm de diámetro, 1,0 mm de profundidad</td></tr><tr><td>Filtros de membrana</td><td>Filtro</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio borosilicatado</td><td>Vidrio para electrodos</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa</td><td>Filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>Filtros de 4 mm, membrana de nailon de .2 µm, carcasa de polipropileno</td></tr><tr><td>Cámara de infrarrojos</td><td>Cámara montada en microscopio</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Cámara de video Extrawave HAD, B7W</td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Estricnina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica del ácido imidazol-4-acético</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larvas de salamandra tigre</td><td>Animal</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de células enteras grabaciones de la luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Utilizamos la técnica de patch clamp de célula entera para estudiar los circuitos sinápticos que subyace en el procesamiento de información visual en la retina. En este vídeo, le guía a través del proceso de desarrollo de células enteras grabaciones de la luz corrientes evocadas de células individuales en la preparación rebanada de la retina. Usamos el medio ambiente acuático salamandra tigre como un modelo animal. Comenzamos con la descripción de la disección de los ojos y mostrar cómo se montan las rebanadas de registros electrofisiológicos. Una vez que el corte se coloca en la cámara de grabación, que muestran cómo realizar grabaciones de células enteras de fijación de voltaje. A continuación, los proyectos de estímulos visuales en los fotorreceptores en el corte de luz para obtener respuestas evocadas actual. Durante la grabación que perfundir en el sector con agentes farmacológicos, por un sistema de perfusión de 8 canales que nos permite cambiar rápidamente entre los diferentes agentes. La preparación rebanada de retina es ampliamente utilizado para las grabaciones de patch clamp en la retina, en particular para estudiar amacrinas o células bipolares, que no son accesibles en una preparación de todo el montaje.

Este vídeo muestra el proceso de células enteras grabaciones pinza de voltaje en la porción de retina de la salamandra tigre acuático. Se demuestra la preparación de la corte, así como la forma de realizar grabaciones de patch clamp durante la estimulación visual de la retina.

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

Utilizamos la técnica de patch clamp de célula completa para estudiar los circuitos sinápticos que subyacen al procesamiento de la información visual en la retina. En este video, nosotros...

Hoy les mostraré cómo preparar cortes de retina del ajolote tigre para grabaciones mediante el método de "patch clamp". Primero, prepararé dos tipos de portaobjetos. Utilizamos portaobjetos que tienen un pozo adhesivo unido a ellos para poder usarlos como cámaras de fluido.En el primer portaobjetos, coloco dos bandas paralelas de grasa al vacío. Luego tomo un papel de filtro y lo corto en piezas rectangulares con una elevación de luz. Ahora coloco una de las piezas sobre los rieles de grasa y la presiono hacia abajo para que quede bien adherida al portaobjetos.Hago lo mismo con la otra pieza. El segundo tipo de portaobjetos tiene pequeños bloques de goma pegados a él. Por ahora, solo añado un poco de grasa para vacío entre los bloques; también coloco una pieza nueva de hoja de afeitar en el cortador de tejidos.Finalmente, preparo las herramientas que necesitaré durante la disección, que son dos pares de pinzas, un par de tijeras y una herramienta para extraer el ojo de la cabeza con el fin de registrar las corrientes inducidas por la luz. La disección debe realizarse bajo luz infrarroja, pero con fines demostrativos, ahora trabajaré a la luz visible. Primero retiro el ojo y lo colo

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

El video describe el registro electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón. Los cortes que contienen el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se colocan en una cámara de registro. Se coloca una pipeta estimulante en el tracto óptico para estimular las células ganglionares de la retina (RGC) e investigar las sinapsis retinogeniculadas o en el núcleo reticularis thalami para estimular las neuronas corticales e investigar las sinapsis...

Un estudio electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón

Este video muestra el registro de respuestas postsinápticas evocadas por la luz en una preparación de corte de tejido retiniano de ratón adaptado a la oscuridad. El corte de retina se coloca en una cámara de registro y se utiliza una pipeta de registro para establecer la continuidad eléctrica con una célula ganglionar de la retina. Se aplican pulsos de luz para generar potenciales postsinápticos excitatorios en las células ganglionares, que son registrados por la pipeta.

Respuestas postsinápticas evocadas por la luz en neuronas de cortes de retina de ratón

Este video demuestra el procedimiento para estudiar la eficiencia sináptica en la corteza entorrinal lateral (LEC) mediante la estimulación optogenética de los axones de la corteza prefrontal medial (mPFC) y el registro de las respuestas de las neuronas piramidales en la LEC. Este método combina registros de patch-clamp con activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica.

Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.

Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Aprende a preparar rebanadas de retina de salamandra tigre para grabaciones de patch clamp. Este método permite estudiar respuestas sinápticas excitatorias evocadas por luz en neurociencia visual.

De células enteras grabaciones de la Luz evocados excitatorios de las corrientes sinápticas en la porción de retina

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