Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Hola, soy Stefan Burani del laboratorio del Dr. Frank Zawa en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de California en Riverside. Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunoprecipitación de cromatina. Así que comencemos.

Este procedimiento comienza con la reticulación con formaldehído de células madre embrionarias humanas antes de la reticulación. Las células madre embrionarias humanas se descongelan durante cinco minutos a 37 grados Celsius a partir de nitrógeno líquido y luego se lavan con medio. A continuación, las células se siembran en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina y se dejan expandir durante dos o tres días.

Para cada reacción de inmunoprecipitación, será necesario partir de entre 50 y 100 millones de células. Primero, las células se fijan y se recogen en suspensión. Se añade formaldehído fresco a cada suspensión celular a una concentración del 1 % y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue un volumen igual a un décimo de 1,25 molar de glicina para neutralizar el formaldehído e incube durante 10 minutos. Lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS y luego recójalas en tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugue los tubos a 1000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recoger las células en un sedimento.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1,5 mililitros de tampón lisis. Finalmente, transfiera las células a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Una vez que las células hayan sido transferidas, congélelas rápidamente tres veces en nitrógeno líquido y luego use un molinillo de tejidos para romperlas.

Una vez que las células están entrecruzadas, están listas para la inmunoprecipitación o pueden almacenarse congeladas a menos 80 grados Celsius indefinidamente. Una vez que haya entrecruzado las células, debe preparar las perlas magnéticas para hacer esto. Añada 50 microlitros de perlas DI a tubos microcéntricos de retención baja de 1,5 mililitros, preparando un tubo de perlas por cada inmunoprecipitación.

Luego agregue un mililitro de solución de bloqueo. Ahora recolecte las perlas de dial con el MPC de dial. Coloque los tubos en el soporte magnético.

Deje que las perlas se acumulen en el costado del tubo. Debe tardar aproximadamente 15 segundos. Puede invertir el portamuestras dos veces para ayudar a recolectar las perlas.

Una vez que se hayan recolectado las perlas, puede eliminar el sobrenadante con una pipeta. Después de haber eliminado el sobrenadante, agregue un mililitro de solución de bloqueo y resuspenda suavemente las perlas retirando la tira magnética del soporte e invirtiendo el soporte. Con el tubo aún en su lugar, puede hacer esto de 10 a 20 veces o hasta que las perlas estén uniformemente distribuidas.

Reuspenda y recoja las perlas como lo hizo previamente. Una vez recolectadas, puede eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita este lavado utilizando 1,5 mililitros de solución de bloqueo.

Después del segundo lavado, puede resuspender las perlas en 750 microlitros de solución de bloqueo y luego agregar 10 microgramos de anticuerpo. En nuestra investigación, utilizamos un anticuerpo contra la proteína MLL, e incubar la mezcla a cuatro grados Celsius durante un mínimo de seis horas o durante la noche en un agitador. Durante esta incubación, puede sonicar su cromatina cruzada, lo cual demostraremos poco después de la incubación nocturna.

Retire la solución de anticuerpo y luego lave las perlas tres veces. Utilice un mililitro de tampón lisador como lo hizo previamente, usando la gradilla magnética para recoger las perlas. Después de los lavados, estará listo para añadir su cromatina saturada.

Antes de comenzar la sonicación, primero debe recuperar los pellet celulares congelados del menos 80 grados Celsius y permitir que se descongelen. Prepare un tubo cónico de 15 mililitros para la sonicación. Esto se hace cortando el tubo en dos partes en la marca de cinco mililitros y descartando la mitad superior.

Los tubos pueden cubrirse con parafina o con la tapa del tubo. Al preparar, utilice un portavasos para colocar el tubo de manera que la sonda ator quede aproximadamente entre 0,5 y un centímetro por encima del fondo del tubo.

Asegúrese de que la sonda esté centrada y no toque los laterales del tubo para evitar la formación de espuma en la solución. Ahora, someta la suspensión a seis rondas de sonicación de 20 segundos cada una. Cada muestra debe mantenerse en un baño de hielo entre las rondas de sonicación para reducir la formación de espuma.

Inicialmente, ajuste la salida de potencia a cero y luego aumente manualmente hasta la potencia final durante el primer pulso. Después de cierta agitación, transfiera el material a un tubo de 1,5 mililitros y luego centrifugue a 13.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Para pelotar los residuos y recolectar el sna.

Transfiera la SINA a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Guarde 50 microlitros del lisado celular de cada muestra como ADN de entrada. Esto se utilizará más adelante para verificar el tamaño de la cromatina compartida.

Esto se puede almacenar a menos 20 grados Celsius. Se debe conservar al menos una alícuota de ADN de entrada por cada lote de lisado sonicado. Ahora estamos listos para inmunoprecipitar la cromatina para amino preciptar la cromatina.

Primero, agregue el equivalente de cromatina de 50 a 100 millones de células del lisado recogido en el paso anterior a 50 microlitros de la mezcla magnética de anticuerpos preparada previamente, hasta un volumen final de un mililitro. Si es necesario, este volumen puede ajustarse con tampón lisis e invirtiendo para resuspender. Incube esta mezcla con los microperlas durante la noche a 4 grados Celsius en el agitador.

Después de la incubación, recopile las perlas utilizando el MPC dyl, coloque los tubos en la rejilla y permita que las perlas se acumulen en el costado del tubo. Esto debería tardar aproximadamente 20 segundos posteriormente. Incline la rejilla dos veces para ayudar a recopilar todas las perlas.

Luego, retire el sobrenadante con una pipeta, cambiando las puntas entre muestras. A continuación, es necesario lavar las perlas. Para ello, agregue un mililitro de tampón lisador a cada tubo y resuspenda suavemente las perlas.

Esto puede hacerse retirando la tira magnética del soporte e invirtiendo el soporte con los tubos aún en su lugar entre 10 y 20 veces, o hasta que las perlas se resuspendan uniformemente. Posteriormente, recopile las perlas reemplazando la tira magnética. Retire el sobrenadante mediante pipeta.

Repita este lavado de tres a cinco veces más. Recuerde cambiar las puntas entre cada lavado. A continuación, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón IP uno, tal como se acaba de describir.

Luego, de manera similar, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón IP2. Finalmente, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón TE con pH 8,0, tal como se hizo con los otros lavados. Elimine el tampón TE después del lavado final.

Ahora, centrifugue a 3000 RPM durante tres minutos a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier tampón TE residual. Las perlas ya están listas para la elución del cromatina. Primero, agregue 210 microlitros de tampón de elución y eluya el material de las perlas incubando los tubos en un mezclador térmico a 65 grados Celsius a 800 RPM durante 15 minutos o hasta 30 minutos para mejorar la recuperación del eluido.

Centrifugar los perles a 13.000 rpm durante un minuto. Después de la centrifugación, retirar 200 microlitros de la fase sobrenadante y transferirlos a un tubo nuevo, y luego añadir 200 microlitros de TE 0.0. Ahora nuestras muestras están listas para CROs enlazar con la inversión del entrecruzamiento del ADN precipitado.

Incube el sobrenadante en un baño de agua a 65 grados Celsius durante un mínimo de seis horas y un máximo de 15 horas. Esta incubación puede realizarse en un baño de agua para minimizar la condensación. A continuación, siga con 50 microlitros de ADN de entrada.

Esto se reservó después de la sonicación para revertir el entrecruzamiento de esta ADN de entrada, incubándolo a 65 grados Celsius, tal como se hizo con el eluido. Ahora estamos listos para purificar el ADN. Luego, el ADN se purifica y precipita mediante extracción con fenol-cloroformo, seguida de técnicas de precipitación con etanol.

Los pellets de ADN precipitados se resuspenden en agua y luego pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius. Para uso futuro, el ADN de entrada purificado puede separarse en un gel de agarosa para verificar el tamaño de la cromatina fragmentada. Idealmente, el fragmento debe tener entre 250 y 750 pares de bases.

Así que acabamos de mostrarle cómo realizar una inmunoprecipitación de cromatina a partir de células madre embrionarias humanas. Cuando realice este experimento, es importante utilizar un anticuerpo de alta afinidad para la cromatina con el rango de tamaño adecuado y realizar pasos de lavado de alta exigencia. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte en sus experimentos.