Name: Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende la técnica de inmunoprecipitación de cromatina en células estaminales embrionarias humanas para estudiar la diferenciación celular. Este método permite analizar interacciones proteína-ADN en investigación de biología del desarrollo.

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El trabajo presentado con el apoyo de una subvención (RS1-00477-1) del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) para FS

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li>
<li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li>
</ol>

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ofrece una técnica valiosa para la disección de la cromatina en los procesos basados ​​en la diferenciación celular. Requisitos previos para el éxito de este método son los anticuerpos buena y la disponibilidad de la cromatina de las células control o tejidos que no tienen el antígeno de interés. Mediante la combinación de chip con la tecnología de microarrays de ADN, una gran cantidad de información puede ser obtenida. La validación de los resultados de chip depende de la disponibilidad de los sistemas de prueba adecuada que se puede vincular la asociación dinámica de las proteínas, las modificaciones de las proteínas y / o ARN con la ejecución de los procesos biológicos durante el desarrollo celular.

<table><tbody><tr><td>Poteinasa-K</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td>RNasa-A</td><td>Reactivo</td><td>Fermentas</td><td>#EN0531</td><td></td></tr><tr><td>formaldehído 37%</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>FX040-13</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Reactivo</td><td>Goldshield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenol:cloroformo:alcohol isoamílico</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>SA, fracción V</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dubecco&amp;rsquo;s</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>9410</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>JT Baker</td><td>4095-02</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>5910</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>9230</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Reactivo</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxicólico, sal sódica</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Reactivo</td><td>Applichem</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>4840</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, proteína A</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>100.02D</td><td></td></tr><tr><td>dynalbeads, proteína G</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcónicos de baja retención, 1,5 ml, Xtreme</td><td>Otros</td><td>Phenix Research Products</td><td>MAX-815S</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 2,0 ml</td><td>Reactivo</td><td>Eppendorf</td><td>955154037</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

La complejidad estructural y funcional de la gran cantidad de células en los organismos metazoarios se debe a un pequeño número de células madre. Las células madre se caracterizan por dos propiedades fundamentales: auto-renovación y multipotencia que permite que una célula madre para diferenciarse en prácticamente cualquier tipo de célula 1. La progresión de células madre de células diferenciadas se caracteriza por la pérdida de los cambios multipotencia, morfológicos y estructurales y la actividad jerárquica de los factores de transcripción y moléculas de señalización, cuyas actividades establecer y mantener el tipo de células-los patrones de expresión de genes específicos. A nivel molecular, la diferenciación celular implica cambios dinámicos de la estructura y composición de la cromatina y la detección de los cambios dinámicos que pueden proporcionar información valiosa sobre las características funcionales de las células madre y el proceso de diferenciación celular 2,3. La cromatina es una muy compactado de ADN-proteína que se forma cuando las células de ADN cromosómico paquete con las proteínas, principalmente histonas 4. Stemcellness y la diferenciación celular se ha correlacionado con la presencia de conjuntos específicos de las proteínas reguladoras, tales como los factores epigenéticos, variantes de histonas y factores de transcripción 2,3,5. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) proporciona un valioso método para controlar la presencia de ARN, proteínas y proteínas modificaciones en la cromatina 6,7. La comparación de la cromatina de diferentes tipos de células pueden dilucidar los cambios dinámicos en las asociaciones de la cromatina proteínas que ocurren durante la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina consiste en la purificación de la in vivo reticulado de la cromatina. La cromatina aislada se reduce a fragmentos más pequeños por digestión enzimática o fuerza mecánica. Fragmentos de cromatina se precipitó utilizando anticuerpos específicos para apuntar a las proteínas o las proteínas y las modificaciones del ADN. El ADN o ARN precipitado se purifica y se utiliza como molde para la PCR o ensayos de microarrays de ADN basado. Requisitos previos para un chip de éxito son los anticuerpos de alta calidad para el antígeno deseado y la disponibilidad de la cromatina de las células control que no expresan la molécula objetivo. Chip puede correlacionar la presencia de proteínas, las proteínas y las modificaciones de ARN, ADN y ARN, con destino específico, y dependiendo de la elección de la herramienta outread, detecta la asociación de moléculas diana en genes específicos o en el contexto de un genoma completo. La comparación de la distribución de las proteínas de la cromatina de células de diferenciación puede dilucidar los cambios dinámicos de la composición de la cromatina que coincide con la progresión de células a lo largo de un linaje celular.

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

La complejidad funcional y estructural de la miríada de células en los organismos metazoos surge de un pequeño número de células madre. Las células madre son...

Hola, soy Stefan Burani del laboratorio del Dr. Frank Zawa en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de California en Riverside. Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunoprecipitación de cromatina. Así que comencemos.Este procedimiento comienza con la reticulación con formaldehído de células madre embrionarias humanas antes de la reticulación. Las células madre embrionarias humanas se descongelan durante cinco minutos a 37 grados Celsius a partir de nitrógeno líquido y luego se lavan con medio. A continuación, las células se siembran en placas de seis pocillos recubiertas con gelatina y se dejan expandir durante dos o tres días.Para cada reacción de inmunoprecipitación, será necesario partir de entre 50 y 100 millones de células. Primero, las células se fijan y se recogen en suspensión. Se añade formaldehído fresco a cada suspensión celular a una concentración del 1 % y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue un volumen igual a un décimo de 1,25 molar de glicina para neutralizar el formaldehído e incube durante 10 minutos. Lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS y luego recójalas en tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugue los tubos a 1000 RPM durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recoger las células en un sedimento. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 1,5 mililitros de tampón lisis. Finalmente, transfiera las células a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Una vez que las células hayan sido transferidas, congélelas rápidamente tres veces en nitrógeno líquido y luego use un molinillo de tejidos para romperlas.Una vez que las células están entrecruzadas, están listas para la inmunoprecipitación o pueden almacenarse congeladas a menos 80 grados Celsius indefinidamente. Una vez que haya entrecruzado las células, debe preparar las perlas magnéticas para hacer esto. Añada 50 microlitros de perlas DI a tubos microcéntricos de retención baja de 1,5 mililitros, preparando un tubo de perlas por cada inmunoprecipitación.Luego agregue un mililitro de solución de bloqueo. Ahora recolecte las perlas de dial con el MPC de dial. Coloque los tubos en el soporte magnético.Deje que las perlas se acumulen en el costado del tubo. Debe tardar aproximadamente 15 segundos. Puede invertir el portamuestras dos veces para ayudar a recolectar las perlas.Una vez que se hayan recolectado las perlas, puede eliminar el sobrenadante con una pipeta. Después de haber eliminado el sobrenadante, agregue un mililitro de solución de bloqueo y resuspenda suavemente las perlas retirando la tira magnética del soporte e invirtiendo el soporte. Con el tubo aún en su lugar, puede hacer esto de 10 a 20 veces o hasta que las perlas estén uniformemente distribuidas.Reuspenda y recoja las perlas como lo hizo previamente. Una vez recolectadas, puede eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita este lavado utilizando 1,5 mililitros de solución de bloqueo.Después del segundo lavado, puede resuspender las perlas en 750 microlitros de solución de bloqueo y luego agregar 10 microgramos de anticuerpo. En nuestra investigación, utilizamos un anticuerpo contra la proteína MLL, e incubar la mezcla a cuatro grados Celsius durante un mínimo de seis horas o durante la noche en un agitador. Durante esta incubación, puede sonicar su cromatina cruzada, lo cual demostraremos poco después de la incubación nocturna.Retire la solución de anticuerpo y luego lave las perlas tres veces. Utilice un mililitro de tampón lisador como lo hizo previamente, usando la gradilla magnética para recoger las perlas. Después de los lavados, estará listo para añadir su cromatina saturada.Antes de comenzar la sonicación, primero debe recuperar los pellet celulares congelados del menos 80 grados Celsius y permitir que se descongelen. Prepare un tubo cónico de 15 mililitros para la sonicación. Esto se hace cortando el tubo en dos partes en la marca de cinco mililitros y descartando la mitad superior.Los tubos pueden cubrirse con parafina o con la tapa del tubo. Al preparar, utilice un portavasos para colocar el tubo de manera que la sonda ator quede aproximadamente entre 0,5 y un centímetro por encima del fondo del tubo.Asegúrese de que la sonda esté centrada y no toque los laterales del tubo para evitar la formación de espuma en la solución. Ahora, someta la suspensión a seis rondas de sonicación de 20 segundos cada una. Cada muestra debe mantenerse en un baño de hielo entre las rondas de sonicación para reducir la formación de espuma.Inicialmente, ajuste la salida de potencia a cero y luego aumente manualmente hasta la potencia final durante el primer pulso. Después de cierta agitación, transfiera el material a un tubo de 1,5 mililitros y luego centrifugue a 13.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Para pelotar los residuos y recolectar el sna.Transfiera la SINA a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Guarde 50 microlitros del lisado celular de cada muestra como ADN de entrada. Esto se utilizará más adelante para verificar el tamaño de la cromatina compartida.Esto se puede almacenar a menos 20 grados Celsius. Se debe conservar al menos una alícuota de ADN de entrada por cada lote de lisado sonicado. Ahora estamos listos para inmunoprecipitar la cromatina para amino preciptar la cromatina.Primero, agregue el equivalente de cromatina de 50 a 100 millones de células del lisado recogido en el paso anterior a 50 microlitros de la mezcla magnética de anticuerpos preparada previamente, hasta un volumen final de un mililitro. Si es necesario, este volumen puede ajustarse con tampón lisis e invirtiendo para resuspender. Incube esta mezcla con los microperlas durante la noche a 4 grados Celsius en el agitador.Después de la incubación, recopile las perlas utilizando el MPC dyl, coloque los tubos en la rejilla y permita que las perlas se acumulen en el costado del tubo. Esto debería tardar aproximadamente 20 segundos posteriormente. Incline la rejilla dos veces para ayudar a recopilar todas las perlas.Luego, retire el sobrenadante con una pipeta, cambiando las puntas entre muestras. A continuación, es necesario lavar las perlas. Para ello, agregue un mililitro de tampón lisador a cada tubo y resuspenda suavemente las perlas.Esto puede hacerse retirando la tira magnética del soporte e invirtiendo el soporte con los tubos aún en su lugar entre 10 y 20 veces, o hasta que las perlas se resuspendan uniformemente. Posteriormente, recopile las perlas reemplazando la tira magnética. Retire el sobrenadante mediante pipeta.Repita este lavado de tres a cinco veces más. Recuerde cambiar las puntas entre cada lavado. A continuación, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón IP uno, tal como se acaba de describir.Luego, de manera similar, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón IP2. Finalmente, lave las perlas de cuatro a seis veces en un mililitro de tampón TE con pH 8,0, tal como se hizo con los otros lavados. Elimine el tampón TE después del lavado final.Ahora, centrifugue a 3000 RPM durante tres minutos a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier tampón TE residual. Las perlas ya están listas para la elución del cromatina. Primero, agregue 210 microlitros de tampón de elución y eluya el material de las perlas incubando los tubos en un mezclador térmico a 65 grados Celsius a 800 RPM durante 15 minutos o hasta 30 minutos para mejorar la recuperación del eluido.Centrifugar los perles a 13.000 rpm durante un minuto. Después de la centrifugación, retirar 200 microlitros de la fase sobrenadante y transferirlos a un tubo nuevo, y luego añadir 200 microlitros de TE 0.0. Ahora nuestras muestras están listas para CROs enlazar con la inversión del entrecruzamiento del ADN precipitado.Incube el sobrenadante en un baño de agua a 65 grados Celsius durante un mínimo de seis horas y un máximo de 15 horas. Esta incubación puede realizarse en un baño de agua para minimizar la condensación. A continuación, siga con 50 microlitros de ADN de entrada.Esto se reservó después de la sonicación para revertir el entrecruzamiento de esta ADN de entrada, incubándolo a 65 grados Celsius, tal como se hizo con el eluido. Ahora estamos listos para purificar el ADN. Luego, el ADN se purifica y precipita mediante extracción con fenol-cloroformo, seguida de técnicas de precipitación con etanol.Los pellets de ADN precipitados se resuspenden en agua y luego pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius. Para uso futuro, el ADN de entrada purificado puede separarse en un gel de agarosa para verificar el tamaño de la cromatina fragmentada. Idealmente, el fragmento debe tener entre 250 y 750 pares de bases.Así que acabamos de mostrarle cómo realizar una inmunoprecipitación de cromatina a partir de células madre embrionarias humanas. Cuando realice este experimento, es importante utilizar un anticuerpo de alta afinidad para la cromatina con el rango de tamaño adecuado y realizar pasos de lavado de alta exigencia. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte en sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aprende la técnica de inmunoprecipitación de cromatina en células estaminales embrionarias humanas para estudiar la diferenciación celular. Este método permite analizar interacciones proteína-ADN en investigación de biología del desarrollo.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

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