Name: Etiquetado retrógrada de las células ganglionares de la retina por la aplicación de Fluoro-Gold en la superficie del colículo superior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Aprenda el etiquetado retrógrado de células ganglionares de la retina con Fluoro-Gold aplicado en el colículo superior. Este método permite evaluar la supervivencia celular y el efecto de fármacos en neurociencia.

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Los autores desean agradecer el apoyo del Programa Nacional de Glaucoma de la Fundación Americana del Asistente de Salud.

<ol><li> Anestesiar la rata por vía intra-peritoneal de ketamina (80mg/kg) y xilazina (8mg/kg) (relación de volumen de 2:1). Aplique un ungüento lubricante ocular estéril para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía. </li><li> Afeitarse el pelo de la cabeza (del ojo a la altura de los oídos) y fijar la cabeza en la etapa de la cabeza por una cabeza de sujeción y establecer sus incisivos en la barra de incisivos. </li><li> Desinfectar el área de operación con una solución de povidona yodada al 10% seguido de 70% de alcohol. </li><li> Cortar la piel y los músculos para exponer el cráneo y las suturas (puntos de sutura sagital, coronal y transversal) (Figura 1). Aplicar bupivicaína analgésicos, como un toque a la zona de la incisión (no más de 2 mg / kg). </li><li> Taladrar un agujero del cráneo (ø 2x2 mm, 0,5 mm de ambos puntos de sutura sagital y transversal) a cada lado de la sutura sagital. Evitar la ruptura de las meninges y los senos que yace bajo las suturas. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Características en el cráneo de rata viva." width="469" height="317" /> Figura 1. Características en el cráneo de rata viva. </li><li> Cortar con tijeras las meninges primavera, evitar que se rompa. </li><li> Aspirar el contenido cerebral que se encuentra sobre la superficie dorsal del colículo superior con cuidado por la bomba de vacío y tres puntos de control se puede observar: <ol><li> el color de los cambios en el tejido cerebral de gris a blanco a gris </li><li> dejar de aspirar cuando el incoloro líquido cefalorraquídeo sale </li><li> cuidadosamente aumentar el nivel más bajo de succión horizontal para exponer el colículo superior, amarillenta cubierta por la duramadre </li></ol></li><li> Aspirar el contenido del cerebro en SC hasta cuatro bordes del SC se puede observar directamente al microscopio. La porción de la corteza cerebral retirado debe mantenerse al mínimo para evitar efectos secundarios indeseables (por ejemplo, disfunción motora). Tenga cuidado de no tocar los senos paranasales. </li><li> Absorber el líquido en el agujero con rayas finas de algodón estéril para que la superficie de la SC lo más seco posible. Luego, coloque una capa delgada de esponja de gelatina remojadas con un 6% Fluoro-Gold en la superficie de Carolina del Sur (FG es absorbido por los terminales de los axones de las células ganglionares de la retina y de forma bilateral transportado retrógradamente a sus somas en la retina). </li><li> Llenar el agujero con espuma de gel y cerrar la herida de la piel con pinzas de sutura. </li><li> Los animales se les permitió recuperarse bajo la lámpara incandescente para mantener el calor. Analgésico buprenorfina, (100mcg/kg), se aplica por vía oral en el agua de bebida durante 5 días después de que el etiquetado SC. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> ¿Por qué usar este método quirúrgico para el recuento de células ganglionares retinianas? En las ratas alrededor del 98% de las células ganglionares de la retina (CGR) se sabe que los proyectos a la contralateral colículo superior (SC). La aplicación de flúor de oro en la superficie del SC puede etiquetar casi todos los de la CGR, por lo que podemos centrarnos en esta neurona retinal más vulnerables en el glaucoma. Comparar con etiquetado retrógrado de RGC poniendo FG en tronco del nervio óptico seccionado por 2 días, la i...

etiquetado retrógrada de las células ganglionares de la retina por la aplicación de fluoro-gold en la superficie del colículo superior

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Células ganglionares de la retina (RGC) de conteo es esencial para evaluar degeneración de la retina, especialmente en el glaucoma. Etiquetado fiable RGC es fundamental para evaluar los efectos de cualquier tratamiento. En las ratas, aproximadamente el 98% de la CGR se sabe que los proyectos a la contralateral colículo superior (SC) (Forrester y Peters, 1967). La aplicación de flúor-oro (FG) en la superficie del SC puede etiquetar casi todos los de la CGR, por lo que podemos centrarnos en esta neurona retinal más vulnerables en el glaucoma. FG es absorbido por los terminales de los axones de las células ganglionares de la retina y de forma bilateral transportado retrógradamente a sus somas en la retina. Comparar con etiquetado retrógrado de RGC poniendo FG en tronco del nervio óptico seccionado por 2 días, la interferencia de la supervivencia de las CGR se reduce al mínimo. Comparar con manchas violeta de cresilo CGR que las manchas, las células amacrinas y el endotelio de los vasos sanguíneos en la capa de células ganglionares retinianas, este método de etiquetado es más específico a la CGR. Este vídeo describe el método de etiquetado retrógrada de las CGR mediante la aplicación de FG en la superficie del SC. Los procedimientos quirúrgicos incluyen la perforación del cráneo, la aspiración de la corteza para exponer la SC y la aplicación de esponja de gelatina sobre toda la superficie dorsal de la SC se muestran. Consejos útiles para evitar la hemorragia intracraneal masiva y la aspiración de la SC se les ha dado.

Este vídeo describe el método de etiquetado retrógrada de las CGR mediante la aplicación de flúor-oro (FG) en la superficie del colículo superior (SC). Técnica consiste en perforar el cráneo, la aspiración de la corteza, y la aplicación de esponja de gelatina sobre toda la superficie dorsal de la SC.

Etiquetado retrógrada de las células ganglionares de la retina por la aplicación de Fluoro-Gold en la superficie del colículo superior

El recuento de células ganglionares de la retina (CGR) es esencial para evaluar la degeneración retiniana, especialmente en el glaucoma. El marcaje fiable de las CGR es fundamental para...

Hola, soy Tu del Laboratorio GOSO en la Universidad de Hong Kong. Hoy voy a explicar cómo etiquetar retrogradamente la rata. Célula ganglionar retiniana.Las células ganglionares de la retina se etiquetarán de forma retrógrada mediante la aplicación de un colorante trazador sobre la superficie del quiasma óptico superior, de modo que posteriormente podamos contar las células ganglionares en la retina preparada en plano para evaluar la muerte celular o el efecto del fármaco aplicado. Esta es una imagen que ilustra la vía desde la retina hasta el quiasma óptico superior. El tinte fluorescente CLE puede transportarse de manera retrógrada desde el quiasma óptico superior CLE a través del tracto óptico.Cruzar el quiasma óptico a través del nervio óptico hasta la retina en el ojo. Utilizamos un microscopio operatorio para realizar la cirugía. Bomba de aspiración para extraer la corteza cerebral sobre la superficie dorsal del estadio de cabeza CLE, con el fin de mantener el sombrero rojo en posición.Se utilizaron una fresa y una sierra para hueso para abrir el cráneo y colocar el gelatina absorbible con el fin de aplicar el colorante fluorescente FG sobre la superficie de los cilios. Los instrumentos se esterilizaron mediante autoclave antes de la intervención, incluyendo pinzas finas, tijeras de resorte, aguja de vacío, punta de fresa y pinzas de sutura. La hoja quirúrgica para cortar la piel, la regla para las mediciones y el algodón también se mantuvieron en condiciones estériles.Analizamos el rojo mediante inyección tónica de ketamina y gel sine. Después de afeitar la zona desde el nivel del ojo hasta el nivel de las orejas, desinfectamos el área operatoria con yodo de propán, seguido de alcohol al 70 %. Luego colocamos el gorro rojo en su posición sobre el soporte de la cabeza.Corte la piel abierta en la línea media de la cabeza, comenzando desde el nivel del ojo hasta el nivel de las orejas. Luego tenemos una buena exposición de la sutura metópica, la sutura sagital, la sutura coronal, y esto es el BMA y esto es el Lambda. Marque el tornillo a 0,5 hasta un milímetro desde la sutura coronal del extremo AL y luego etiquételos en ambos lados, nuevamente en espejo, para asegurarse de que la marca esté al menos a 0,5 milímetros de distancia de las suturas.Luego podemos comenzar a perforar un orificio a lo largo del lado marcado, controlando la velocidad y dirección del taladro hasta lograr una ruptura amplia de las meninges y del revestimiento del seno por debajo de la sutura. Detenga la perforación cuando el diámetro sea de aproximadamente dos milímetros. Luego, comenzamos nuevamente desde el otro lado para asegurarnos de que el orificio tenga el tamaño adecuado y esté en la posición correcta.Corte las meninges con las tijeras de resorte. Utilice una pinza fina para limpiar los restos óseos del orificio. Ahora podemos comenzar la aspiración utilizando la bomba de vacío. La primera capa del BR es la sustancia verde, que se corta junto con las meninges nuevamente.Luego puede observarse que el color de la célula T cambia a blanco. Estas son las sustancias blancas del suero. Realice la aspiración de forma cuidadosa y lenta.Ahora podemos ver nuevamente las sustancias grises. El color es menos blanco. Pueden ver que es gris en la parte inferior.Veo. Así que pueden observar que sale el LCR claro. Eso significa que estamos alcanzando la superficie dorsal del cuerpo superior. De nuevo, un orificio ampliado a este nivel. Y luego, en la parte inferior, podemos observar el color amarillento de la duramadre que cubre el clúster superior. Se realiza la aspiración horizontal a este nivel para evitar dañar el contenido del clúster superior.Luego podemos comenzar como un todo. Usted ve la materia verde. De hecho, es de color verde.Luego llegamos a la sustancia blanca. El color del tejido es blanco. Ahora puede verse cómo el LCR aparece debajo de ese color gris tan nítidamente.Retire esa última capa de materia gris y entonces se expone la duramadre amarilla. Tenga cuidado ahora al interrumpir la duramadre sobre los distintos pulsadores y luego amplíe el orificio. Intente asegurarse de que todo el borde de los pulsadores pueda observarse bajo el microscopio.Sujete la pinza de cabeza del estadio de cabeza en diferentes ángulos y realice algunas aspiraciones finales hasta que los cuatro bordes del ELC puedan observarse directamente bajo el microscopio. Absorba el líquido en el orificio con una tira de algodón fino para que la superficie del ELC sea lo más resistente posible. Tome una pieza de gelatina, póngala en un punto previamente revestido con oro en combustible al 6 % y sepárela en piezas ecológicas.Hágalo en una capa delgada y de tamaño un poco mayor que toda la superficie dorsal de la parte superior. Colóquelo cuidadosamente sobre la superficie de los cliques superiores y luego sobre el lado opuesto. Póngalo dentro del orificio cubriendo toda la superficie del clúster. A través de los orificios con mayor salida de chorro decreciente.Finalmente, cierre la herida cutánea con clips de sutura y limpie la herida después de la cirugía, coloque al animal en una jaula limpia y permita que se recupere. Manténgalo en condiciones cálidas. El animal se comporta normalmente tras la operación mientras está despierto.Siete días después de la etiquetado con SC, diseccionamos la retina y la montamos plana, luego contamos las células ganglionares retinianas y el microscopio epinal utilizando filtro UV. Dado que el 98 % de las células ganglionares retinianas proyectan hacia los cuerpos geniculados superiores, un etiquetado ST confiable es fundamental para la evaluación de la progresión de la enfermedad y el efecto de fármacos. Este es un ejemplo de una célula ganglionar retiniana etiquetada de forma retrógrada en una retina montada plana.

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Investigación

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Biología

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La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Transección del nervio óptico es un modelo ampliamente utilizado de la lesión en el SNC adulto. Este modelo es ideal para llevar a cabo una serie de manipulaciones experimentales que se dirigen a la retina a nivel mundial o directamente dirigidos a la población heridos neuronal de las células ganglionares de la retina.

Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

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Fuente: Inal, M. A. et. al., Trazado retrógrado de Drosophila neuronas motoras embrionarias utilizando tintes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el método de etiquetado retrógrado de las neuronas motoras Drosophila utilizando tintes lipofílicos. El tinte entra en el axón, viaja retrógradamente y etiqueta las neuronas de color verde, lo que permite una visualización detallada de su morfología y proyecciones bajo un microscopio confocal.

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