Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

Hola, soy Lauren Frank del Laboratorio de Emmanuel Pothos en el departamento de Farmacología y Terapéutica Experimental de la Escuela de Medicina de la Universidad Tufts. Y yo soy Emmanuel Pothos. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar cultivos primarios de células dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de neonatos roedores.

Este procedimiento incluye los siguientes pasos: preparar herramientas y reactivos, diseccionar el mesencéfalo de cerebros de roedores desde P cero hasta P dos, disociar los segmentos cerebrales y sembrar las neuronas disociadas. Así que comencemos.

En este procedimiento, hay una serie de pasos de preparación que deben realizarse con antelación, de dos a tres semanas antes de generar el cultivo de neuronas dopaminérgicas. Las células gliales deben sembrarse para que tengan tiempo de proliferar y cubrir el fondo de las placas. Las neuronas dopaminérgicas primarias se cultivarán sobre una monocapa de células gliales de uno a siete días antes del cultivo primario de células neuronales. Retire el medio de las células gliales y sustitúyalo por dos mililitros de medio neuronal fresco el día anterior al cultivo de AC; todos los elementos, excepto los instrumentos de disección, deben esterilizarse mediante luz ultravioleta, incluyendo 12 placas de disección.

Dos viales de disociación con una barra magnética microscópica. Dos tapas de vial con dos pequeños orificios perforados en la parte superior. Anillos deslizantes separados.

Y la caja de anillos deslizantes, recuerde dejarla abierta. Todas estas herramientas se recubren con etanol al 70% antes de comenzar el día del cultivo. Primero, tome todos los componentes para la solución de pepane que se utilizará para disociar la solución de neuronas primarias del congelador y permita que se descongelen.

Configure una placa calefactora para calentar un vaso de precipitados con agua hasta 34 grados Celsius para la digestión y prepare agua saturada con carbógeno para la oxigenación de la solución de pepane. Durante la digestión, se preparan 15 tubos estériles llenos con cuatro a seis mililitros de PBS estéril para lavar los cerebros antes de la disección, y se colocan en hielo. Se dispensan de 20 a 30 mililitros de medio neuronal fresco y se colocan en el incubador.

A continuación, se prepara el vial de disociación utilizando una unidad de filtración estéril con tapa abatible para filtrar la solución de pepane, la cual se transfiere luego al vial de disociación con una tapa estéril de 25 mililitros; inserte una jeringa estéril, haga un orificio en la tapa, que se conecta a un filtro de 0,2 micrones. Conecte el carbógeno al filtro y sujete esto en su lugar con película de parafina. Coloque el vial en el disco de poliestireno expandido.

Una vez que el vial de disociación esté en su lugar, asegúrese de que la barra magnética de agitación esté en movimiento. El gas está entrando en el vial y la temperatura se ha estabilizado a 34 grados Celsius. Se introduce el microscopio de disección en la cabina y se colocan los instrumentos de disección sobre papel de aluminio.

Luego coloque un cuadrado grande de papel de aluminio y 12 cuadrados más pequeños. Deje un par de tijeras para las decapitaciones junto al papel de aluminio. Coloque una caja de espuma de poliestireno con agua helada fuera de la campana extractora.

A continuación, prepare el anestésico, que es una mezcla de 0,075 mililitros de ketamina y 0,075 mililitros de xilazina. Luego obtenga al menos 12 crías de P cero a P dos para placas de 135 milímetros con un vidrio de 23 milímetros. Para ratones, asegúrese de que haya coincidencia de genotipo para toda la camada.

Si el genotipo es desconocido, las células de cada animal deberán sembrarse en placas separadas y se deberán mantener registros precisos para asociar las células con los resultados posteriores de genotipificación. Para comenzar la disección, anestesie al primer animal mediante una inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina. Cuando el animal no responda a la prueba de movimiento de la cola, colóquelo en agua con hielo durante 30 segundos hasta que se hipotérmico.

Luego, enjuague una pequeña hoja de aluminio, así como las tijeras de decapitación y la cabeza del animal, con etanol al 70 % para evitar la contaminación del tejido cerebral durante la disección; decapite con las tijeras, deje caer la cabeza sobre el cuadrado de aluminio y trasládela bajo la campana. Retire suavemente el cerebro cortando primero la piel con las tijeras pequeñas para exponer el cráneo. Corte alrededor del cráneo 360 grados.

Luego retire el casquete craneal con pinzas. Saque el cerebro del cráneo utilizando una espátula pequeña y colóquelo en un tubo de 15 mililitros con hielo. Coloque el tubo con PBS frío de nuevo sobre hielo antes de extraer el siguiente cerebro S.

Repita las disecciones hasta que haya tres cerebros en tubos separados sobre hielo. Vierta un cerebro y PBS sobre el primer platillo de disección. Bajo el microscopio, coloque el cerebro sobre una plataforma de pegamento sill guard que sirva de cojín para que la hoja permanezca afilada.

Utilice una pipeta de transferencia para colocar los segmentos en un tubo nuevo con PBS a fin de lavarlos antes de transferirlos a la solución de pepain. Inicie un cronómetro cuando se introduzcan los primeros segmentos; continúe con las disecciones hasta que todos los cerebros estén en proceso de digestión. En pap pain.

Los primeros segmentos cerebrales habrán estado digiriéndose durante aproximadamente una hora. Para cuando se añadan los últimos segmentos, permita que la digestión continúe durante otra hora. Asegúrese de que la temperatura en el baño de peptona se estabilice a 34 grados Celsius.

Para comenzar el paso de rotación, utilice una pipeta de transferencia para colocar los segmentos cerebrales en un tubo estéril de 15 mililitros. Intente evitar llevar exceso de solución de pepano. Sin embargo, si esto ocurre, elimine el exceso de pepano.

A continuación, lave los segmentos añadiendo dos mililitros de medio neuronal precalentado desde el incubador. Deje que los segmentos sedimenten y luego deseche con cuidado la mayor cantidad posible de solución sin perturbar los segmentos. Realice un total de tres lavados.

Recuerde cambiar las pipetas entre lavados para evitar contaminación utilizando una pipeta nueva en cada transferencia. Comience las iteraciones en dos mililitros de medio neuronal. Triture 25 veces, evitando introducir burbujas de aire.

Luego, deje que los segmentos no asociados se sedimenten durante tres minutos. Utilice una pipeta de transferencia para recoger la mayor cantidad posible de sobrenadante sin perturbar los segmentos del fondo. Mantenga el sobrenadante en un nuevo tubo estéril de 15 mililitros.

Repita el paso anterior utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros y luego una punta de 200 microlitros, tras lo cual los segmentos deben aparecer completamente disociados a simple vista. El sobrenadante de todas las etapas se recoge en el mismo tubo de 15 mililitros. Estamos listos para sembrar las células; finalmente, itere 10 veces con una pipeta de transferencia para obtener una suspensión celular homogénea para el recuento.

Utilizando una punta estéril de pipeta amarilla, cubra cada punta de la pinza. Coloque cuidadosamente un anillo portaobjetos lo más centrado posible sobre el vidrio. Dentro de cada placa, estos anillos se utilizarán para aislar un área dentro de la placa de cultivo donde se sembrarán las neuronas.

Utilice la punta de la pipeta para deslizar los anillos sobre el pocillo central de cada placa. A continuación, agregue suavemente el volumen adecuado de células a la placa. Añada las células al centro del anillo que ya ha colocado en la placa.

Recuerde cambiar las puntas para cada placa. A continuación, agregue cien microlitros de solución diluida de GDNF lo más cerca posible del exterior del anillo en cada placa para favorecer la proliferación de neuronas. Luego, se añade el inhibidor de la mitosis fluoro dioxina o FDU fuera del anillo para evitar que las células gliales crezcan en exceso.

Los extremos de las puntas de pipeta suelen devolverse al incubador y permitir que las células se asienten durante la noche; al día siguiente, utilizando puntas de pipeta estériles para cubrir las puntas de la pinza, retire los anillos, devuelva las placas al incubador y manipúlelas lo menos posible hasta el momento de los experimentos. Revise las placas diariamente en busca de posible contaminación y, si se observa alguna, retire inmediatamente las placas problemáticas. Los cultivos estarán listos para su uso en experimentos de electrofisiología, biología molecular e inmunocitoquímica dentro de tres semanas.

Ahora que las células han sido sembradas, analicemos algunos ejemplos representativos de las células en cultivo. Aquí observamos un cultivo primario que fue sembrado hace 14 días. Este es un ejemplo de un buen cultivo porque se pueden ver cuerpos celulares bien definidos con prolongaciones que emergen de ellos.

Además, observe la ausencia de cualquier crecimiento de moho o hongos en la placa, lo que indicaría una infección. Acabamos de mostrarle cómo generar cultivos primarios disociados de células dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de roedores neonatos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener un ambiente estéril, utilizar únicamente neonatos de P cero a P dos, sembrar sobre sustratos gliales sanos con medio condicionado por células gliales y mantener una densidad de siembra constante.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.