Name: Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Aprende a generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de roedores recién nacidos. Este método permite estudiar la liberación de dopamina y sus mecanismos de exocitosis en tiempo real.

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El trabajo fue apoyado por DK065872 (PEV), una familia Smith Premio de la Fundación de Excelencia en Investigación Biomédica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) y P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

Los métodos descritos aquí permiten la resolución de multa de características morfológicas y neuroquímicas de las neuronas dopaminérgicas centrales que se que no esta disponible en un enfoque sistémico o en vivo.

Los materiales están incluidos en el texto del protocolo.

primaria disociada mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

La capacidad de crear cultivos celulares primarios de neuronas de la dopamina permite el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas de dopamina en el aislamiento de la entrada general a partir de otras partes del cerebro. En nuestro laboratorio, usamos estas neuronas para evaluar la cinética de liberación de la dopamina con amperometría de fibra de carbono, así como los niveles de expresión de genes relacionados con la dopamina y las proteínas utilizando la PCR cuantitativa y la inmunocitoquímica. En este video, te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores. El proceso consiste en varios pasos, incluyendo el revestimiento de los astrocitos corticales gliales, el condicionamiento de medios de cultivo celular neuronal por el sustrato gliales, la disección del cerebro medio, en los recién nacidos, la digestión, extracción y revestimiento de las neuronas de dopamina y la adición de factores neurotróficos a garantizar la supervivencia celular. Las aplicaciones adecuadas para esta preparación incluye la electrofisiología, la inmunocitoquímica, PCR cuantitativa, la microscopía de vídeo (es decir, de la fusión vesicular en tiempo real con la membrana plasmática), los ensayos de viabilidad celular y otras pantallas toxicológicos.

Primaria disociada del cerebro medio de cultivos celulares permiten la dopamina para el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas dopaminérgicas. Pueden ser utilizados para monitorear en tiempo real la cinética de la liberación de dopamina y de la proteína / niveles de ARNm de los reguladores de la exocitosis de dopamina. Aquí te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores.

Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

La capacidad de crear cultivos celulares primarios de neuronas dopaminérgicas permite estudiar las características presinápticas de estas neuronas de forma aislada...

Hola, soy Lauren Frank del Laboratorio de Emmanuel Pothos en el departamento de Farmacología y Terapéutica Experimental de la Escuela de Medicina de la Universidad Tufts. Y yo soy Emmanuel Pothos. Hoy les mostraremos un procedimiento para generar cultivos primarios de células dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de neonatos roedores.Este procedimiento incluye los siguientes pasos: preparar herramientas y reactivos, diseccionar el mesencéfalo de cerebros de roedores desde P cero hasta P dos, disociar los segmentos cerebrales y sembrar las neuronas disociadas. Así que comencemos.En este procedimiento, hay una serie de pasos de preparación que deben realizarse con antelación, de dos a tres semanas antes de generar el cultivo de neuronas dopaminérgicas. Las células gliales deben sembrarse para que tengan tiempo de proliferar y cubrir el fondo de las placas. Las neuronas dopaminérgicas primarias se cultivarán sobre una monocapa de células gliales de uno a siete días antes del cultivo primario de células neuronales. Retire el medio de las células gliales y sustitúyalo por dos mililitros de medio neuronal fresco el día anterior al cultivo de AC; todos los elementos, excepto los instrum

primary-dissociated-midbrain-dopamine-cell-cultures-from-rodent

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

Este video describe un método para cultivar neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón. El proceso incluye el tratamiento del mesencéfalo con una enzima proteolítica, la separación de las células y el cultivo de las mismas en cubreobjetos recubiertos de polímeros en un medio rico en nutrientes con antibióticos para su crecimiento y viabilidad a largo plazo.

Cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón

El video muestra el proceso de aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón. Los pisos ventrales aislados del mesencéfalo se disocian mediante enzimas. Las neuronas dopaminérgicas resultantes se recolectan y se transfieren a microislas dentro de placas de pocillos múltiples. Las células se incuban con un medio neuronal dopaminérgico para mantener las células a una alta densidad dentro de las microislas.

Aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón en el mesencéfalo

Este video demuestra el proceso de cuantificación de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas embrionarias de dopamina de ratón pretratadas con fibrillas preformadas de alfa-sinucleína. Describe los pasos para fijar, teñir y cuantificar las neuronas dopaminérgicas que contienen agregados de alfa-sinucleína mediante inmunofluorescencia.

Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Las neuronas dopaminérgicas desempeñan un papel regulador vital en el cerebro. Su pérdida se asocia con la enfermedad de Parkinson. En este vídeo, mostramos cómo generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas centrales a partir de mesencéfalo de ratón embrionario. Tales cultivos son útiles para estudiar la extrema vulnerabilidad de estas neuronas a diversos estreses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.

Estudio de la acumulación preformada de la dopamina fibril-sinucleina en las neuronas de dopamina de cerebro medio del ratón embrionario primario

Este protocolo describe el cultivo celular de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo humano, seguido de la tinción inmunológica y la generación de perfiles fenotípicos neuronales a partir de imágenes microscópicas adquiridas de alto contenido que permiten la identificación de variaciones fenotípicas debidas a modulaciones genéticas o químicas.

Perfil fenotípico de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo derivadas de células madre humanas

Aprende a generar cultivos primarios de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo a partir de roedores recién nacidos. Este método permite estudiar la liberación de dopamina y sus mecanismos de exocitosis en tiempo real.

Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

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