Name: Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a mantener células madre embrionarias humanas en condiciones libres de células alimentadoras mediante pasajes continuos y confirmación de pluripotencia por microscopía de inmunofluorescencia. Este método simplifica el cultivo de hESCs.

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Estudios en humanos con células madre embrionarias en el laboratorio Teitell el apoyo de un Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM), las semillas de subvención RS1-00313. Agradecemos a los miembros del Centro de Medicina Regenerativa de amplias e Investigación de Células Madre de la UCLA, en especial el Dr. Amander Clark, el doctor Jerome Zack, y los miembros del Fondo para el UCLA amplio núcleo de célula madre Instituto por el apoyo de nuestros estudios.

células madre de mantenimiento cultura cotidiana <ol><li> los medios de comunicación la cultura células madre debe ser cambiado cada 24 horas. Desde el frasco ES medios se almacenan a 4 ° C, retirar la cantidad de solución necesaria (~ 20 ml por cada 6 y placa), en un tubo de 50 ml de halcón, y calentar a 37 ° C en un baño de agua. Una vez que los medios de comunicación se calienta, añade bFGF se almacenan a 4 ° C a una concentración final de 10ng/ml. Poner el stock de bFGF volver a 4 º C inmediatamente después de su uso! </li><li> Eliminar de las placas de 6 pocillos, pero todos ~ 500μl de los medios de comunicación. Asegúrese de girar la placa de cultivo de suspender los desechos para su eliminación. Asegúrese de que el bFGF en los medios de células madre a la cultura se mezcla y añadir 3 ml de medio fresco de nuevo a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Vuelva a colocar la placa en la incubadora. </li></ol> HESCs división de MEFs en Matrigel Por lo general, una confluencia de 6 pocillos de hESCs en MEFs se puede dividir 01:02-01:03 Matrigel en placas de 6 pocillos, con los pozos cada vez más confluentes 4-5 días después de partir. <ol><li> Cuando hESCs dividir en Matrigel, MEF acondicionado medios de comunicación (CM) se utiliza para mantener la pluripotencialidad. MEF acondicionado medios de comunicación se realiza por adelantado. En el primer día, 1,5 × 10 7 γ-irradiado MEFs se siembran en un frasco T75. En el segundo día, MEFs se lavan una vez con una temperatura ambiente de 1 × PBS, pH 7,4, y luego 15 ml de los medios de comunicación ES complementado con 5ng/ml bFGF se añade a la botella. (NOTA: MEFs se sembraron en frascos pequeños o más grandes, pero la proporción entre la densidad de las células y el volumen de los medios de comunicación ES debe ser constante.) El frasco se incuba a 37 ° C durante otras 24 horas. En el tercer día, el CM se recoge y se reemplaza con 15 ml de los medios de comunicación ES fresco suplementado con 5ng/ml bFGF. El CM recogidos se almacenan a 4 ° C. MEF acondicionado medios de comunicación de un revestimiento de MEFs se cosechan más de siete días consecutivos, para generar 15 x 7 = 105ml. Después de siete días, todas las fracciones de CM se reúnen, se filtra de manera estéril, alícuotas y almacenado a -20 ° C. Los medios de comunicación CM preparado como se describe puede ser almacenada y utilizada durante 1 mes. </li><li> Un día antes de partir células madre, puesto alícuotas de Matrigel en tubos Eppendorf a 4 ° C para descongelar la noche (una alícuota contiene 76.2mg de Matrigel, y esta es la cantidad necesaria para un 6 y placa). En el día de partir, tomar un vial de la Matrigel descongelado para una de 6 pocillos, ponga el vial y 6 ml de frío DMEM/F12 los medios de comunicación sobre el hielo. Transferir el Matrigel en el DMEM/F12 los medios de comunicación y mezclar bien. Añadir 1 ml de la solución a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Agitar la placa para distribuir Matrigel en la superficie y se incuba la placa Matrigel cubierto a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de la división de la hESCs. </li><li> hESCs en MEFs se lavan una vez con PBS 1X, pH 7,4. Posteriormente 1 ml de agua tibia IV colagenasa (1mg/ml) se añade a cada pocillo de la placa de 6 pocillos y luego la placa se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de los medios de comunicación ES sin bFGF a cada pocillo. Use una pipeta de 1 ml a soplar las células madre de la placa. Recoge todos los medios que contienen grupos de hESCs y MEFs muertos en un tubo de 50 ml de halcón. Vamos a grupos grandes de las células de resolver durante 5-10 minutos para que los grupos células madre forma una bolita en la parte inferior del tubo, mientras que el MEFs permanecen suspendidas en el sobrenadante. Descartar el sobrenadante y lavar por la resuspensión de células madre utilizando los medios de comunicación de pellets ES carece de bFGF, seguido de centrifugación a temperatura ambiente a 200 g por 5 min. </li><li> A la placa de las células madre en las placas de Matrigel, primero se deben lavar los platos Matrigel con la temperatura ambiente DMEM/F12 (1 ml por pocillo) y la adición de 2,5 ml de la CM complementado con 10ng/ml bFGF por pozo. Resuspender el precipitado en un volumen adecuado de CM complementado con 10ng/ml bFGF, pipeta la suspensión de células de arriba a abajo varias veces hasta que los grumos se uniforme y de tamaño pequeño. Alícuota de la suspensión a 0,5 ml por pocillo en la placa de Matrigel. Tenga en cuenta que la densidad de las colonias en Matrigel es mayor que la densidad de las colonias por la división habitual en MEFs. Colocar la placa en un 37 ° C tejidos incubadora de la cultura. </li><li> Para mantener la hESCs en Matrigel, los medios de comunicación CM complementado con 10ng/ml bFGF se cambia cada 24 horas durante un máximo de 4-5 días. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Este video muestra cómo hESCs paso de placas MEF alimentador de placas Matrigel libres de células. Tenga en cuenta que la densidad de las colonias en Matrigel es mayor que la densidad de las colonias por la división habitual en MEFs. La tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo o microscopía para los marcadores de células madre pluripotencia, tales como Oct-4 y SSEA-4, son necesarios para confirmar el mantenimiento de hESCs en estado indiferenciado en condiciones de cultivo libre de alimentación.

<table><tbody><tr><td>Sustituto de suero para knockout (KSR)</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reactivo</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Reactivo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reactivo</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Oct-4</td><td>Reactivo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugado con fito&amp;#8211;eritrina, ratón IgG3</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG de conejo conjugado con FITC</td><td>Reactivo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

desde mefs a matrigel 2: la división de hescs mefs en matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), las células de alimentación, la forma de hESCs paso de placas MEF a la celda sin alimentador de placas Matrigel.

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

Este video demuestra cómo cultivar células madre embrionarias humanas (hESC) sobre células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), y cómo realizar el pasaje de hESC desde MEF...

Para mantener el cultivo de células madre embrionarias humanas, el medio de cultivo debe cambiarse cada 24 horas. Para ello, comience con una botella stock de medio para células madre embrionarias almacenada a cuatro grados Celsius. Retire la cantidad de solución necesaria, que normalmente es de aproximadamente 20 mililitros por seis.Coloque la placa de cultivo y transfiera esa cantidad a un tubo Falcon de 50 mililitros y caliente el tubo con su contenido a 37 grados Celsius en un baño de agua. Una vez que el medio esté caliente, añada el FGF, que se ha almacenado a cuatro grados Celsius, hasta una concentración final de 10 nanogramos por mililitro. Asegúrese de recordar colocar inmediatamente después el stock de BFGF de vuelta a cuatro grados Celsius.Asegúrese de que el BFGF en el medio de cultivo de células madre humanas esté completamente mezclado. A continuación, retire todo el medio de cada pocillo, dejando aproximadamente 500 microlitros por pocillo. Luego, agregue tres mililitros de medio fresco nuevamente a cada pocillo de una placa de seis pocillos y coloque la placa de nuevo en el incubador.Ahora que les hemos mostrado cómo mantener células madre embrionarias humanas en ONMs, a continuación les mostraremos cómo transferirlas a matrigel. Para dividir células madre embrionarias humanas cultivadas en ONMs y transferirlas a matrigel, comenzamos con una placa de seis pocillos confluente de células madre sobre mes, que puede dividirse uno a dos o uno a tres sobre matrigel. Placas de seis pocillos.Esto permitirá que los pocillos vuelvan a alcanzar la confluencia cuatro o cinco días después de la división. Al dividir células madre embrionarias humanas sobre matrigel, utilice medio condicionado con meth para mantener la pluripotencia; el medio condicionado con meth se prepara con antelación. Esto se realiza recogiendo diariamente el medio, suplementado con cinco nanogramos por mililitro de BFGF, proveniente de un cultivo en crecimiento de meth durante siete días; el medio para células madre embrionarias se utiliza para reemplazar el medio condicionado con meth eliminado.Cada día. El medio condicionado con metotrexato debe utilizarse durante un máximo de un mes después de su recolección y almacenamiento congelado. El día anterior a la división de las células madre embrionarias humanas, trasladamos alícuotas de matrigel en tubos EOR desde menos 20 grados Celsius a cuatro grados para descongelar durante la noche.Una alícuota contiene dos miligramos de matri gel, que es la cantidad necesaria para una placa de seis pocillos. En el día de la siembra, tome un vial del matri gel descongelado.Para cada placa de seis pocillos, mezcle cada vial con seis mililitros de medio D-M-E-M-F 12 frío. Recuerde mantener esto sobre hielo. Añada un mililitro de la solución a cada pocillo de una placa de seis pocillos.Luego, agite suavemente la placa para distribuir el matrigel sobre la superficie e incube la placa recubierta con matrigel a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de dividir las células madre embrionarias humanas. Antes de dividir las células madre embrionarias humanas, lave las células madre en MES una vez con un XPBS pH 7,4. A continuación, agregue un mililitro de colagenasa cuatro tibia a una concentración de un miligramo por mililitro a cada pocillo que vaya a dividir, e incube la placa a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos.Después de la incubación, agregue un mililitro de medio para células madre embrionarias sin BFGF a cada pocillo; utilice una pipeta de un mililitro para desprender las células madre de la placa. Recopile todo el medio que contenga agregados de células madre y MES y colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los agregados grandes de células sedimenten durante cinco minutos, de modo que los agregados de células madre formen un sedimento en el fondo del tubo mientras que los MES permanezcan en suspensión en el sobrenadante.Una vez que las células parezcan haberse asentado, deseche el sobrenadante y lave las células resuspendiendo el pellet de células madre embrionarias. Utilice medio para células madre embrionarias sin BFGF y luego centrifugue a temperatura ambiente a 200 × g durante cinco minutos. Mientras las células están centrifugándose, podemos preparar las placas de matrigel para la siembra de células madre lavando las placas con D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente a razón de un mil por pocillo, y agregando 2,5 mililitros de medio condicionado suplementado con 10 nanogramos por mililitro.FGFB por pocillo tras la centrifugación. Resuspender, suspender el sedimento en un volumen adecuado de medio condicionado con metionina suplementado con 10 nanogramos por mililitro de FGFB, pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta que los grumos sean uniformes y peque&ntilde;os en tama&ntilde;o.A continuación, alícuote la suspensión a 0,5 mililitros por pocillo en la placa de matrigel para obtener un volumen final de tres mililitros por pocillo. Para el matrigel, utilizamos una densidad de colonias más alta que en la división habitual en placas una vez que se han añadido las células. Coloque la placa en un incubador de cultivo tisular a 37 grados Celsius.Para mantener las células madre embrionarias humanas en condición de matrigel. El medio suplementado con 10 nanogramos por mililitro de FGFb se cambia cada 24 horas durante un máximo de cuatro a cinco días.Las células madre embrionarias humanas suelen estar contaminadas con cantidades residuales de MEF después de la primera división sobre Matrigel; la segunda división de Matrigel a Matrigel eliminará por completo cualquier rastro de células alimentadoras que contaminen el cultivo de células madre.

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video se demuestra cómo nuestro laboratorio de rutina pasajes HUES líneas embrionarias humanas de células madre con tripsina.

HUES pases madre de embriones humanos líneas celulares con tripsina

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

Este video muestra la forma de mantener el crecimiento de células madre embrionarias humanas (hESCs) en el alimentador de células libres de condiciones y la forma de hESCs paso continuo en el alimentador de células libres de condiciones. La confirmación de células madre cultivadas en el alimentador de pluripotencia de células en condiciones libres por microscopía de inmunofluorescencia se demuestra también.

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

La calidad de fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) está dictada por la cepa derecha de ratón tal como CF-1. Pluripotencia-MEFs de apoyo y medios de comunicación condicionado (CM) obtenido a partir de éstas debe contener concentraciones óptimas de activina A, Gremlin y Tgfβ1 necesarios para la Activina / Nodal y las vías de FGF de manera cooperativa mantener la auto-renovación y pluripotencialidad.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.

La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), basados en el crecimiento de células individuales disociadas de monocapa (NCM) de tipo no colonia. Este nuevo método, que utiliza inhibidores de la quinasa asociada a Rho o la isoforma de laminina 521 (LN-521), es adecuado para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas, la manipulación genética y el descubrimiento de fármacos.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Aprende a mantener células madre embrionarias humanas en condiciones libres de células alimentadoras mediante pasajes continuos y confirmación de pluripotencia por microscopía de inmunofluorescencia. Este método simplifica el cultivo de hESCs.

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

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