Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

Para mantener el cultivo de células madre embrionarias humanas, los medios de cultivo deben cambiarse cada 24 horas. Para hacer esto, comience con una botella de medios de células madre embrionarias almacenada a cuatro grados centígrados. Saque la cantidad de solución necesaria, que suele ser de unos 20 mililitros por seis.

Coloque esa cantidad en un tubo Falcon de 50 mililitros y caliente el tubo con su contenido a 37 grados centígrados en un baño de agua. Una vez que se haya calentado el medio, agregue el FGF, que se ha almacenado a cuatro grados Celsius hasta una concentración final de 10 nanogramos por mil. Asegúrese de recordar volver a colocar el caldo de BFGF a cuatro grados centígrados inmediatamente después de su uso.

Asegúrese de que el BFGF en el medio de cultivo de células madre amox humanas esté completamente mezclado. A continuación, retire todos los medios de cada pocillo dejando unos 500 microlitros por pocillo. A continuación, vuelva a añadir tres mililitros de medio fresco a cada pocillo de una placa de seis pocillos y vuelva a colocar la placa en la incubadora.

Ahora que le hemos mostrado cómo mantener las células madre embrionarias humanas ONM, a continuación le mostraremos cómo transferirlas a matrigel. Para dividir las células madre embrionarias humanas cultivadas en ONM en matrigel, comenzamos con una placa Cofluent de seis pocillos de células madre en mes, que se puede dividir de uno a dos o de uno a tres en matrigel. Placas de seis pocillos.

Esto permitirá que los pozos vuelvan a ser confluentes cuatro o cinco días después de la división. Al dividir las células madre embrionarias humanas en matrigel, use medios de condición de metanfetamina para mantener la pluripotencia Los medios acondicionados de metanfetamina se fabrican con anticipación. Esto se hace recolectando el medio, que se complementa con cinco nanogramos por mil BFGF de un cultivo de metanfetamina en crecimiento todos los días durante siete días, se utilizan medios de células madre embrionarias para reemplazar el medio acondicionado de metanfetamina eliminado.

Todos los días. Los medios acondicionados con metanfetamina deben usarse hasta un mes después de que se recolectan y almacenan congelados. El día antes de la división de las células madre embrionarias humanas, movemos las alícuotas de matrigel en tubos EOR de menos 20 grados Celsius a cuatro grados para descongelarlas durante la noche.

Una alícuota contiene dos miligramos de gel de matri, que es la cantidad necesaria para un seis. Plato de pozo. El día de la división, tome un vial del gel de matri descongelado.

Para cada seis, cubra y mezcle cada vial con seis mililitros de medios fríos D-M-E-M-F 12. Recuerde mantener esto en hielo. Agregue un mililitro de la solución a cada pocillo de una placa de seis pocillos.

A continuación, gire la placa para distribuir matrigel en la superficie e incube la placa cubierta de matrigel a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de dividir las células madre embrionarias humanas. Antes de dividir las células madre embrionarias humanas, lave las células madre en MES una vez con un pH XPBS 7.4. A continuación, agregue un mililitro de colagenasa tibia cuatro a un miligramo por mil a cada pocillo para los pocillos que está dividiendo, y luego incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos.

Después de la incubación, agregue un mililitro de medio de células madre embrionarias sin BFGF a cada uno, use una pipeta de un mililitro para soplar las células madre de la placa. Recoja todos los medios que contengan grupos de células madre y més muertas en un tubo de halcón de 15 mililitros. Deje que los grandes grupos de células se asienten durante cinco minutos para que los grupos de células madre formen una bolita en el fondo del tubo mientras las mes permanecen suspendidas en el snat.

Una vez que las células parezcan haberse asentado, deseche el sobrenadante y lave las células suspendiendo la pelita de células madre embrionarias. Utilizando medios de células madre embrionarias sin BFGF, la siguiente centrífuga a temperatura ambiente a 200 veces G durante cinco minutos. Mientras las células están girando, podemos preparar las placas de matrigel para la siembra de células madre lavando las placas con D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente a una milésima de pulgada por pocillo, y añadiendo 2,5 mililitros de medio acondicionado suplementado con 10 nanogramos por mil.

BFGF por pocillo después de la centrifugación. Resus, suspenda el pellet en un volumen adecuado de medio acondicionado con metanfetamina suplementado con 10 nanogramos por mil. BFGF, pipetea la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta que los grumos se vuelvan uniformes y de tamaño pequeño.

A continuación, alícuota la suspensión a 0,5 mililitros por pocillo en la placa matrigel para lograr tres milésimas de pulgada por pocillo como el volumen final. Para el matrigel, usamos una densidad de colonias más alta que para la división habitual en matemáticas una vez que se han agregado las celdas. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.

Para mantener las células madre embrionarias humanas en condiciones de metanfetamina. Medios suplementados con 10 nanogramos por mil. El BFGF se cambia cada 24 horas durante un máximo de cuatro a cinco días.

Las células madre embrionarias humanas generalmente están contaminadas con cantidades residuales de MEF después de la primera división en matrigel, la segunda división de matrigel a Matrigel eliminará por completo cualquier rastro de células alimentadoras que contaminen el cultivo de células madre.