Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

Hola, soy Cody Locke del Laboratorio Caldwell del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama. Soy Kyle Lee y te mostraré cómo preparar gusanos para ensayos de exposición a carbohidratos y PTZ. Soy Bernard Tu y te demostraré cómo realizar ensayos de carbohidratos.

Soy Kaylin Berry y soy la responsable de los vídeos de Sea Elegance. En esta presentación, estaré narrando esta presentación y demostrando el ensayo de exposición PTZ. Hoy mis colegas y yo mostraremos cómo caracterizar mutantes de transmisión sináptica con un modelo de epilepsia después de la exposición a PTZ y Alde carb con una serie de cepas mutantes representativas.

Así que comencemos. Kyle Lee comenzará hoy mostrando la preparación de los ensayos de carbohidratos ALD en el primer día del procedimiento. Asegúrese de que al menos 30 gusanos en etapa adulta joven de cada genotipo y de cada réplica estén disponibles para los ensayos de carbohidratos ALD el segundo día.

Lo mejor es que un experimentador seleccione 50 o más lombrices de cuatro etapas L en placas NGM frescas libres de fungicidas asentadas con E. coli OP 50 como fuente de alimento. Cultive los gusanos durante 12 a 24 horas a una temperatura constante y permisiva. Lo mejor es de 20 grados centígrados a 22 grados centígrados, aunque aceptables son 25 grados centígrados.

El segundo día, prepare una solución madre de 100 milimolares de Al Decarb y etanol al 70%, extienda la cantidad adecuada de Al Decarb en placas NGM. Utilizamos constantemente 0,5 milimolares al Decarb enchapando 37,5 microlitros de 100 milimolares de carburador alde en placas de Petri de 60 milímetros sin ventilación con 7,5 mililitros en gm. Deje que las placas de carburador alde se sequen durante aproximadamente 30 a 60 minutos a temperatura ambiente.

No es necesario romper las tapas después de que los platos estén secos. Agregue volúmenes consistentes de E. coli en el centro de cada placa de carbohidratos alde y seque durante otros 30 a 60 minutos. A temperatura ambiente, normalmente añadimos 25 microlitros de E. coli OP 50.

Este volumen de OP 50 crea un césped alimentario de tamaño suficiente para mantener los gusanos en un pequeño punto del centro del plato sin aglomerarse. Una vez que el césped esté seco, proceda con los ensayos de carbohidratos alba. Debido a la naturaleza subjetiva de los ensayos de carbohidratos ALD, se recomienda encarecidamente que los experimentos se realicen a ciegas.

Para ello. Un colega del experimentador principal vuelve a etiquetar las placas originales que contienen los gusanos que se van a analizar, o el colega podría transferir los gusanos de las placas originales a las placas de cifrado de carburadores inmediatamente antes de iniciar un temporizador. Ahora que las placas de boro han sido sied, ABO procederá con el análisis para comenzar el análisis, cuente el número de gusanos paralizados.

Hay dos enfoques principales para definir la parálisis aguda inducida por el descarboxilado. El primer abordaje define la parálisis por el cese del bombeo faríngeo. En esta nota de video, una estructura oscura que está situada dentro de la luz de la faringe del gusano a la derecha de la pantalla.

Esta estructura se llama molinillo y se contrae rítmicamente a través de un mecanismo colinérgico. La locomoción del gusano en este video se ha ralentizado en gran medida debido a la exposición al Al Decarb. Sin embargo, la trituradora faríngea de este gusano sigue moviéndose claramente.

Por lo tanto, este gusano no se paraliza por un cese de la definición de bombeo. Uno debería ver en este video que el molinillo faríngeo ubicado a la derecha de la pantalla no se contrae con el cese del bombeo como la definición de trabajo para la parálisis inducida por al Decarb. Este gusano debe ser calificado como paralizado.

Sin embargo, al igual que el gusano del video anterior, este gusano exhibe ligeros movimientos de búsqueda de alimento de lado a lado. A pesar de tener su locomoción afectada por el Al Decarb, estos movimientos impedirían que un experimentador considerara a este gusano paralizado por el segundo enfoque para definir la parálisis inducida por el Al Decarb, la inmovilidad de todo el cuerpo y la falta de respuesta al tacto. El segundo enfoque para definir la parálisis inducida por el descarboxilador consiste en pinchar constantemente cada gusano con un alambre de platino y comprobar si hay una respuesta.

Si los movimientos corporales no se pueden detectar a simple vista, nuestro enfoque preferido es pinchar a nuestros gusanos dos veces en la cabeza y dos veces en la cola cada 30 minutos durante un total de tres horas. Como deberías ver, el gusano de este video no está obviamente moviendo su cuerpo. Sin embargo, debido a que este gusano responde a la punzada moviendo claramente su cola, no llamamos a este gusano paralizado.

Según la segunda definición de parálisis inducida por al descarboxilador. Al igual que el gusano en el video anterior, este gusano obviamente no está moviendo su cuerpo y, por lo tanto, requiere una prueba de pinchazo. Sin embargo, a diferencia del gusano del video anterior, este gusano no responde claramente a la insistencia.

Por lo tanto, este gusano está paralizado por la segunda definición de parálisis inducida por al descarboxilado. Aunque la diferencia entre paralizado y no paralizado por alde carb puede ser sutil, los experimentadores deberían ser capaces de identificar alteraciones sustanciales y transmisión sináptica simplemente observando un gran número de gusanos representativos expuestos al Al Decarb inmediatamente después de ser recogidos en las placas de Al Decarb. Los gusanos de tipo salvaje siguen siendo móviles.

En este video. Uno verá los mismos gusanos de tipo salvaje del video anterior después de una hora de exposición al Al Decarb. Tenga en cuenta que los gusanos se están desacelerando hasta cierto punto, pero todavía se están moviendo claramente.

A diferencia de los gusanos de tipo salvaje, los mutantes de Tomasin one en este video están completamente inmovilizados o apenas se mueven después de una hora de exposición. Este resultado es consistente con los mutantes de tomasina one que tienen un exceso de secreción de acetilcolina debido a la incapacidad de regular negativamente la liberación de neurotransmisores en las uniones neuromusculares, el exceso de acetilcolina y las hendiduras sinápticas en las uniones neuromusculares combinado con la inhibición de la degradación de la acetilcolina, Bial Decarb hace que los mutantes de tomasina one sean hipersensibles, aunque no se muestra aquí, se han postulado resultados similares que surgen de ensayos de alde carb con pérdida de alelos de función de on 43, que codifica el ortologaritmo C elegance de la proteína quinasa dependiente de calcio cal Moulin dos. Este video muestra 25 mutantes, que son deficientes en la transmisión inhibitoria de GABAérgica.

Después de una hora de exposición a alde carb, similar a los mutantes tomasina one y M 43, estos mutantes muestran alteraciones locomotoras significativas inducidas por alde carb e y parecen estar más afectados que los gusanos de tipo salvaje con exposición a al Decarb durante un período de tiempo idéntico. Este resultado es consistente con que los mutantes M 25 han sobreestimulado los músculos de la pared corporal debido a una combinación de exposición al Decarb y una transmisión GABAérgica reducida, lo que conduce a una mayor relación de transmisión excitatoria a inhibitoria en las uniones neuromusculares de CL EL y la parálisis posterior. Sin embargo, debido a que los mutantes tomasina uno en 43 y en 25 exhiben sensibilidades similares a Al Decarb en este momento.

A pesar de tener diferentes causas para la sobreestimulación de los músculos de la pared corporal, un experimentador no podría conocer el mecanismo subyacente de la hipersensibilidad sin conocer primero las identidades de las mutaciones causantes. Para este video, volvimos a los mismos gusanos de tipo salvaje de un video anterior después de tres horas de exposición al Decarb en este punto terminal de nuestro ensayo de carbohidratos ALD, uno debería ver claramente que estos gusanos, a pesar de ser de tipo salvaje, están completamente inmovilizados o apenas se mueven. Estos gusanos ahora son fenotípicamente similares a los mutantes TOM one y M 25 que se muestran una hora después de la exposición al carbohidrato alde, presumiblemente porque la transmisión colinérgica excitatoria ha alcanzado niveles comparables en contraste con los gusanos de tipo salvaje, los mutantes Synap Bren uno permanecen considerablemente móviles a las tres horas de exposición al carbohidrato alde.

Este resultado es consistente con los mutantes sinaptivos de Bren uno, que carecen de niveles normales de secreción de neurotransmisores, teniendo menos estimulación colinérgica en los músculos de la pared corporal que los gusanos de tipo salvaje de la madera después de niveles idénticos de exposición a todos los carbohidratos en este momento. El punto en cuatro mutantes, que son específicamente deficientes en la transmisión colinérgica, deberían tener sensibilidades similares a las del Al Decarb como mutantes sinaptivos de Bren uno. Por el contrario, los mutantes hipersensibles Tomasin one y O 25 permanecen paralizados, no muy diferentes de los gusanos de tipo salvaje.

Vale la pena señalar que algunos gusanos, especialmente aquellos que son resistentes al Al Decarb, pueden intentar arrastrarse fuera del plato. En este caso, el experimentador puede esparcir una cantidad constante de ácido palmítico, una barrera física para la locomoción de los gusanos. Alrededor de las placas de Al Decarb, esparcimos 25 microlitros de 10 miligramos de ácido palmítico por mililitro de etanol.

Eso completa el paradigma de exposición al Al Decarb. Ahora, demostraré el paradigma de exposición al terazol Penta Lean. Kaylin Berry nos ayudará con los ensayos PTZ.

La preparación de gusanos para los ensayos PTZ es esencialmente la misma que la preparación de gusanos para los ensayos de carbohidratos alde. Las únicas diferencias significativas entre los dos ensayos son las siguientes. Utilizamos DDH dos O como disolvente PTZ en lugar de etanol al 70%.

Además, debido a que con frecuencia colocamos grandes volúmenes de PTZ que de carburador ALDE, dejamos que las placas se sequen durante al menos una hora antes de agregar OP 50. El ácido palmítico también se puede usar con PTZ. Además, es importante tener en cuenta que el PTZ es mucho menos estable que el carbohidrato y debe almacenarse a menos 20 grados centígrados.

Para comenzar el análisis, cuente el número de gusanos epilépticos que convulsionan levemente cada 30 minutos durante un total de una hora. Lo mejor es anotar el número de gusanos con diferentes tipos de convulsiones en categorías separadas, como convulsiones de cuerpo completo, convulsiones anteriores, que llamamos combinación de convulsiones anteriores con parálisis muscular de la pared corporal, que llamamos tónico-clónico o parálisis de cuerpo completo, que llamamos tónico tónico. La actividad similar a las convulsiones, como se ve con el gusano de la derecha, a menudo sigue a las convulsiones tónico-clónicas como se ve con el gusano del tónico izquierdo.

La actividad similar a las convulsiones podría ser simplemente el resultado de la fatiga muscular después de convulsiones tónico-clónicas repetitivas. Sin embargo, nuestros datos no publicados indican que algunos gusanos pueden volverse tónicos en PTZ de una manera similar a la parálisis inducida por al descarboxilado sin haber sido previamente tónico-clónicos. Aquí mostramos un gusano mutante de transmisión sináptica representativo que se arrastra en ausencia de PTZA, antagonista del receptor GABA e inductor común de convulsiones en varios modelos animales de convulsiones y epilepsia.

Tenga en cuenta que la punta o la nariz del gusano se balancea de un lado a otro mientras busca alimento. En este video, mostramos otro gusano de la misma cepa mutante de transmisión sináptica utilizada en el video anterior. Observe que este gusano, que está en presencia de 2,5 miligramos de PTZ por mililitro de agua, en su mayoría continúa moviendo la cabeza de un lado a otro mientras busca alimento.

Sin embargo, este gusano ocasionalmente se detiene buscando alimento de un lado a otro y, en cambio, empuja repetidamente su parte anterior hacia adelante. Finalmente, uno debería ver un gusano que porta la misma mutación que los gusanos de los dos videos anteriores en presencia de 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua. Observe que este gusano ha disminuido el forrajeo de lado a lado y está empujando su parte anterior hacia adelante con una mayor frecuencia e intensidad que con la concentración más baja de PTZ.

Estos resultados demuestran la dependencia de la dosis de PTZ, que observamos con todos los mutantes de transmisión sináptica sensibles a PTZ. Es importante destacar que la exposición a PTZ no es suficiente para inducir convulsiones epilépticas en gusanos de tipo salvaje. Del mismo modo, hemos intentado, pero no observado, convulsiones epilépticas inducidas por PTZ en gusanos con déficits específicos en la transmisión colinérgica, como en el cuatro, o en gusanos con transmisión colinérgica excesiva, como la tomasina.

Por lo tanto, debería ser factible caracterizar aún más los mutantes de la transmisión sináptica con resistencia a todos los carbohidratos debido a déficits en la función sináptica general o déficits específicos en la transmisión colinérgica basados en sus sensibilidades relativas a PTZ. Quizás sorprendentemente, una fuerte reducción de la función del mutante ONC 25, que carece de expresión detectable de GABA en la elegancia C. Las neuronas motoras inhibitorias no presentan convulsiones epilépticas espontáneas como se ve en este vídeo.

Un mutante ONC 25 en 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua. Sin embargo, exhibe convulsiones tónico-clónicas robustas, aunque no se muestran anteriores, solo convulsiones con algún movimiento precedieron a las convulsiones tónico-clónicas asociadas a ONC 25 e imitaron las convulsiones de los mutantes de Bren one de la sinapsis. Por lo tanto, un experimentador no debe asumir que todos los mutantes inhibidores de GABA exhibirán convulsiones tónico-clónicas o una actividad similar a las convulsiones tónicas estrechamente asociada en presencia de PTZ, especialmente considerando la probabilidad de obtener alelos mutantes hipomórficos.

Ahora que hemos demostrado hipersensibilidad a alde carb y a PTZ por mutantes inhibidores de GABA, pero solo hipersensibilidad a alde carb y sensibilidad normal a PTZ por mutantes que carecen de regulación negativa de la transmisión colinérgica. Uno podría preguntarse cómo se ven los mutantes de pérdida de función UNC 43 en PTZ, ya que también son hipersensibles al carburador Alda como nuestros otros mutantes de transmisión sináptica en 43 mutantes que no exhiben convulsiones epilépticas obvias en ausencia de PTZ, aunque estos mutantes tienen contracciones raras no repetitivas, pero aún espontáneas de cuerpo completo, después de la exposición a 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua en 43, Mutantes de pérdida de función presentes, convulsiones corporales robustas, repetitivas y dependientes de la dosis. En este momento, estos resultados son ambiguos, pero parecen indicar que en 43 no debe tener un papel específico en la transmisión inhibitoria de GABAérgico o un papel solo en la regulación negativa de la liberación de neurotransmisores.

En el sistema nervioso C elegance, acabamos de mostrarle cómo caracterizar los mutantes de transmisión sináptica CL elgan con estimulantes neuronales complementarios, alde carb, un inhibidor de la colinesterasa y un antagonista del receptor PTZA GABA. Al seguir un paradigma farmacológico complementario, recuerde que el grado de sensibilidad a un estimulante neural no puede predecir el grado de sensibilidad al otro estimulante neural. La utilización de ensayos de carbohidratos alde debería ayudar a distinguir los mutantes inhibidores de GABA, que encabezan Bob en PTZ, pero son hipersensibles a Alde carb de los mutantes deficientes en función sináptica general. que también encabezan Bob en PTZ, pero son resistentes a todos los carbohidratos. Además, hay que tener en cuenta que los mutantes inhibidores de GABA dirigen a Bob en PTZ, mientras que los gusanos que carecen de regulación negativa de la transmisión colinérgica aparecen en el tipo salvaje en PTZ.

Por lo tanto, el ensayo PTZ también podría emplearse para distinguir entre estas clases de mutantes de transmisión sináptica, que son hipersensibles al carbohidrato Alde. En resumen, un enfoque complementario con ensayos de carbohidratos PTZ y Alde debería permitir a un experimentador caracterizar los mutantes de transmisión sináptica elegantes de C de una manera que es imposible con cualquiera de los fármacos por separado. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.