Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

Hola, soy Cody Locke del Laboratorio Caldwell en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama. Soy Kyle Lee y les mostraré cómo preparar gusanos para ensayos de exposición a outta carb y PTZ. Soy Bernard Tu y les demostraré cómo realizar ensayos de outta carb.

Soy Kaylin Berry y soy responsable de los videos de sea Elegance. En esta presentación, narraré este contenido y demostraré el ensayo de exposición a PTZ. Hoy, mis colegas y yo mostraremos cómo caracterizar mutantes de transmisión sináptica mediante un modelo de epilepsia en sea Elegance tras la exposición a PTZ y Aldecarb, utilizando una serie de cepas mutantes representativas.

Así que comencemos. Kyle Lee nos guiará hoy mostrando la preparación de los ensayos de carbohidratos ALD en el primer día del procedimiento. Asegúrese de que al menos 30 gusanos en estadio de adultos jóvenes de cada genotipo y de cada réplica estarán disponibles para los ensayos de carbohidratos ALD en el segundo día.

Es recomendable que un experimentador seleccione 50 o más lombrices en estadio L4 y las coloque en placas NGM frescas sin fungicida, sembradas con E. coli OP50 como fuente de alimento. Incube las lombrices durante 12 a 24 horas a una temperatura constante y permisiva. Lo ideal es entre 20 grados Celsius y 22 grados Celsius, aunque es aceptable 25 grados Celsius.

El segundo día, prepare una solución stock de Al Decarb de 100 milimolar y etanol al 70 %, y distribuya la cantidad adecuada de Al Decarb sobre placas de NGM. Utilizamos consistentemente Al Decarb a 0,5 milimolar, agregando 37,5 microlitros de Al Decarb 100 milimolar a placas de Petri de 60 milímetros sin ventilación con 7,5 mililitros de gm. Deje secar las placas con Al Decarb durante aproximadamente 30 a 60 minutos a temperatura ambiente.

No es necesario agrietar las tapas después de que las placas estén secas. Añada volúmenes consistentes de E. coli en el centro de cada placa de aldehído carbónico y seque durante otros 30 a 60 minutos. A temperatura ambiente, normalmente añadimos 25 microlitros de E. coli OP50.

Este volumen de OP 50 crea un césped alimenticio de tamaño suficiente para mantener los gusanos en un pequeño punto en el centro de la placa sin sobrecargarlo. Una vez que el césped alimenticio esté seco, continúe con los ensayos de alba carb. Debido a la naturaleza subjetiva de los ensayos de ALD carb, se recomienda encarecidamente que los experimentos se realicen de forma ciega.

Para hacer esto, un colega del experimentador principal deberá volver a etiquetar las placas originales que contienen los gusanos que se van a analizar, o bien el colega podría transferir los gusanos de las placas originales a placas con etiquetas codificadas inmediatamente antes de iniciar el cronómetro. Ahora que las placas han sido codificadas, ABO procederá con el análisis para comenzar a contar el número de gusanos paralizados.

Existen dos enfoques principales para definir la parálisis inducida por alcalosis aguda y descarbonatación. El primer enfoque define la parálisis por la cesación del bombeo faríngeo. En esta nota de video, una estructura oscura que se sitúa dentro de la luz de la faringe del gusano a la derecha de la pantalla.

Esta estructura se denomina molinete y se contrae rítmicamente mediante un mecanismo colinérgico. La locomoción del gusano en este video se ha ralentizado considerablemente debido a la exposición a Al Decarb. Sin embargo, el molinete faríngeo de este gusano sigue moviéndose claramente.

Por lo tanto, este gusano no está paralizado según la definición de cese del bombeo. En este video se debe observar que el molinillo faríngeo ubicado a la derecha de la pantalla no se está contrayendo, lo cual constituye la definición operativa de parálisis inducida por al Decarb. Este gusano debe calificarse como paralizado.

Sin embargo, al igual que el gusano del video anterior, este gusano está exhibiendo ligeros movimientos laterales de forrajeo. A pesar de que su locomoción está afectada por Al Decarb, estos movimientos impedirían que un experimentador considerara que este gusano está paralizado según el segundo criterio para definir la parálisis inducida por Al Decarb: inmovilidad total del cuerpo e insensibilidad al tacto. El segundo enfoque para definir la parálisis inducida por Al Decarb consiste en punzar consistentemente a cada gusano con un alambre de platino y verificar si hay respuesta.

Si los movimientos corporales no pueden detectarse a simple vista, nuestro enfoque preferido consiste en pinchar dos veces en la cabeza y dos veces en la cola a nuestros gusanos cada 30 minutos durante un total de tres horas. Como podrá observar, el gusano en este video no mueve visiblemente su cuerpo. No obstante, dado que este gusano responde al pinchazo moviendo claramente su cola, no consideramos que esté paralizado.

Según la segunda definición, la parálisis inducida por aldehído carbónico. Como el gusano del video anterior, este gusano no mueve visiblemente su cuerpo y por lo tanto requiere una prueba de estimulación mecánica. Sin embargo, a diferencia del gusano del video anterior, este gusano no responde claramente a la estimulación.

Por lo tanto, este gusano queda paralizado según la segunda definición de parálisis inducida por aldehído carbónico. Aunque la diferencia entre paralizado y no paralizado por aldehído carbónico puede ser sutil, los experimentadores deberían poder identificar alteraciones sustanciales y la transmisión sináptica simplemente observando un gran número de gusanos representativos expuestos a Aldehído Carbónico inmediatamente después de ser transferidos a placas con Aldehído Carbónico. Los gusanos de tipo silvestre aún son móviles.

En este video, se observarán los mismos gusanos de tipo silvestre del video anterior, tras una hora de exposición a la descarbonatación con Al. Nótese que los gusanos están disminuyendo su movimiento en cierto grado, pero aún se desplazan claramente.

A diferencia de los gusanos de tipo silvestre, los mutantes tomasin uno en este video están completamente inmovilizados o apenas se mueven tras una hora de exposición. Este resultado es coherente con que los mutantes tomasin uno presenten una secreción excesiva de acetilcolina debido a la incapacidad de regular negativamente la liberación del neurotransmisor en las uniones neuromusculares, lo que provoca un exceso de acetilcolina en las hendiduras sinápticas de las uniones neuromusculares, combinado con la inhibición de la degradación de acetilcolina. Bial Decarb hace que los mutantes tomasin uno sean hipersensibles, aunque no se muestra aquí, se ha postulado que resultados similares surgen de ensayos con alde carb con alelos de pérdida de función de on 43, que codifica el ortólogo de C. elegans de la quinasa dependiente de calcio y calmodulina dos. Este video muestra mutantes on 25, que presentan deficiencia en la transmisión inhibitoria GABAérgica.

Después de una hora de exposición al aldecarb, al igual que los mutantes tomasin uno y M43, estos mutantes muestran alteraciones significativas inducidas por aldecarb en la locomoción y parecen verse más afectados que los gusanos de tipo salvaje tras la exposición al aldecarb durante un tiempo idéntico. Este resultado es consistente con la hipótesis de que los mutantes M25 presentan una sobreestimulación de los músculos de la pared corporal debido a una combinación de la exposición al aldecarb y una transmisión GABAérgica reducida, lo que lleva a una mayor relación entre transmisión excitatoria e inhibitoria en las uniones neuromusculares de CL ELs y, consecuentemente, a parálisis. Sin embargo, dado que los mutantes tomasin uno en 43 y en 25 exhiben sensibilidades similares al aldecarb en este punto temporal.

A pesar de tener causas diferentes para la sobreestimulación de los músculos de la pared corporal, un experimentador no podría conocer el mecanismo subyacente de la hipersensibilidad sin antes conocer las identidades de las mutaciones causantes. Para este video, regresamos a los mismos gusanos de tipo silvestre de un video anterior tras tres horas de exposición a al Decarb; en este punto terminal de nuestro ensayo ALD carb, se debe observar claramente que estos gusanos, a pesar de ser de tipo silvestre, están completamente inmovilizados o apenas se mueven. Ahora estos gusanos son fenotípicamente similares a los mutantes TOM uno y M 25 mostrados a una hora después de la exposición a alde carb, presumiblemente porque la transmisión colinérgica excitatoria ha alcanzado niveles comparables. En contraste con los gusanos de tipo silvestre, los mutantes Synap Bren uno permanecen considerablemente móviles tras tres horas de exposición a alde carb.

Este resultado es coherente con los mutantes Synaptive Bren uno, que carecen de niveles normales de secreción de neurotransmisores y presentan menos estimulación colinérgica en sus músculos de la pared corporal que los gusanos de tipo salvaje tras exposiciones idénticas a alde carb en este momento. Los mutantes punto en cuatro, que son deficientes específicamente en la transmisión colinérgica, deberían tener sensibilidades similares a Al Decarb que los mutantes Synaptive Bren uno. Por el contrario, los mutantes Tomasin uno y O 25 hipersensibles permanecen paralizados, al igual que los gusanos de tipo salvaje.

Vale la pena señalar que algunos gusanos, especialmente aquellos resistentes al Al Decarb, pueden intentar salirse de la placa. En este caso, el experimentador puede distribuir una cantidad constante de ácido palmítico, una barrera física para la locomoción de los gusanos. Alrededor de las placas de Al Decarb, distribuimos 25 microlitros de 10 miligramos de ácido palmítico por mililitro de etanol.

Esto completa el paradigma de exposición Al Decarb. Ahora, demostraré el paradigma de exposición Penta Lean Terazol. Kaylin Berry nos ayudará con los ensayos de PTZ.

La preparación de los gusanos para los ensayos con PTZ es esencialmente la misma que la preparación de los gusanos para los ensayos con aldehído carbónico. Las únicas diferencias significativas entre ambos ensayos son las siguientes. Utilizamos DDH dos O como disolvente de PTZ en lugar de etanol al 70 %.

Además, dado que con frecuencia se siembran volúmenes más grandes de PTZ que de aldehído carbónico, se deja secar las placas durante al menos una hora antes de añadir OP 50. El ácido palmítico también puede utilizarse con PTZ. Asimismo, es importante tener en cuenta que el PTZ es mucho menos estable que el aldehído carbónico y debe almacenarse a menos 20 grados Celsius.

Para comenzar el análisis, cuente cada 30 minutos el número de gusanos con convulsiones epilépticas inducidas por luz durante un total de una hora. Es recomendable clasificar el número de gusanos con diferentes tipos de convulsiones en categorías separadas, como convulsiones de cuerpo completo, convulsiones anteriores, que denominamos movimientos bruscos de cabeza, combinación de convulsiones anteriores con parálisis de los músculos de la pared corporal, que denominamos tónico-clónicas, o parálisis de cuerpo completo, que denominamos tónica-tónica. La actividad similar a convulsiones, como se observa en el gusano de la derecha, suele seguir a las convulsiones tónico-clónicas, como se observa en el gusano de la izquierda tónico.

La actividad similar a una convulsión podría deberse simplemente a la fatiga muscular tras convulsiones tónico-clónicas repetitivas. Sin embargo, nuestros datos no publicados indican que algunos gusanos pueden volverse tónicos con PTZ de manera similar a la parálisis inducida por al decarb, sin haber experimentado previamente convulsiones tónico-clónicas. Aquí mostramos un gusano mutante en la transmisión sináptica representativo desplazándose en ausencia de PTZ, un antagonista del receptor de GABA y un inductor común de convulsiones en diversos modelos animales de crisis epilépticas y epilepsia.

Tenga en cuenta que la punta o cabeza del gusano oscila de un lado a otro mientras busca alimento. En este video, mostramos otro gusano de la misma cepa mutante de transmisión sináptica utilizada en el video anterior. Observe que este gusano, que se encuentra en presencia de 2,5 miligramos de PTZ por mililitro de agua, continúa principalmente moviendo su cabeza de un lado a otro mientras busca alimento.

Sin embargo, este gusano ocasionalmente interrumpe la búsqueda de alimento de un lado a otro y, en cambio, empuja repetidamente su extremo anterior hacia adelante. Por último, se debe observar un gusano que porta la misma mutación que los gusanos de los dos videos anteriores, en presencia de 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua. Observe que este gusano presenta una búsqueda de alimento de lado a lado reducida y empuja su extremo anterior hacia adelante con mayor frecuencia e intensidad que con la concentración más baja de PTZ.

Estos resultados demuestran la dependencia de la dosis de PTZ, que observamos en todos los mutantes de transmisión sináptica sensibles al PTZ. Es importante destacar que la exposición al PTZ no es suficiente para inducir convulsiones similares a las epilépticas en gusanos de tipo salvaje. Asimismo, hemos intentado, pero no observado, convulsiones inducidas por PTZ similares a las epilépticas en gusanos con déficits específicos en la transmisión colinérgica, como en four, o en gusanos con transmisión colinérgica excesiva, como tomasin one.

Por lo tanto, debería ser factible caracterizar aún más a los mutantes de transmisión sináptica con resistencia al aldehído carbónico, ya sea por déficits en la función sináptica general o por déficits específicos en la transmisión colinérgica, basándose en sus sensibilidades relativas al PTZ. Quizás sorprendentemente, un mutante fuerte de reducción de función ONC 25, que carece de expresión detectable de GABA en las neuronas motoras inhibitorias de C. elegans, no presenta convulsiones epilépticas espontáneas como las observadas en este video.

Un mutante ONC 25 en 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua. Sin embargo, presenta convulsiones tónico-clónicas robustas, aunque no se observaron convulsiones anteriores únicamente con cierto movimiento previo a las convulsiones tónico-clónicas asociadas al ONC 25 y que imitan las convulsiones de los mutantes synap Bren uno. Por lo tanto, un experimentador no debería asumir que todos los mutantes de GABA inhibitorio presentarán convulsiones tónico-clónicas o actividad similar a crisis tónicas estrechamente asociadas en presencia de PTZ, especialmente considerando la probabilidad de obtener alelos mutantes hipomórficos.

Ahora que hemos demostrado hipersensibilidad al alde carb y al PTZ mediante mutantes GABA inhibidores, pero solo hipersensibilidad al alde carb y sensibilidad normal al PTZ en mutantes que carecen de regulación negativa de la transmisión colinérgica, uno podría preguntarse cómo se comportan los mutantes con pérdida de función de UNC-43 frente al PTZ, ya que también son hipersensibles al alde carb. Al igual que nuestros otros mutantes de transmisión sináptica, los mutantes en 43 no presentan convulsiones epilépticas evidentes en ausencia de PTZ, aunque estos mutantes sí tienen contracciones espontáneas completas del cuerpo, raras y no repetitivas. Sin embargo, tras la exposición a 10 miligramos de PTZ por mililitro de agua, los mutantes con pérdida de función en 43 presentan convulsiones completas del cuerpo robustas, repetitivas y dependientes de la dosis. En este momento, estos resultados son ambiguos, pero parecen indicar que on 43 no debe tener un papel específico en la transmisión GABAérgica inhibitoria, ni un papel exclusivo en la regulación negativa de la liberación de neurotransmisores.

En el sistema nervioso de C. elegans, acabamos de mostrarle cómo caracterizar mutantes de la transmisión sináptica de CL elegans mediante estimulantes neuronales complementarios: aldecarb, un inhibidor de la colinesterasa, y PTZ, un antagonista del receptor GABA. Al seguir un paradigma farmacológico complementario, recuerde que el grado de sensibilidad a un estimulante neuronal no puede predecir el grado de sensibilidad al otro estimulante neuronal. La utilización de ensayos con aldecarb debería ayudar a distinguir a los mutantes GABA inhibidores, que muestran movimientos oscilantes de la cabeza con PTZ pero son hipersensibles al aldecarb, de los mutantes deficientes en la función sináptica general, que también muestran movimientos oscilantes de la cabeza con PTZ pero son resistentes al aldecarb. Además, se debe tener en cuenta que los mutantes GABA inhibidores presentan movimientos oscilantes de la cabeza con PTZ, mientras que los gusanos que carecen de regulación negativa de la transmisión colinérgica parecen de tipo silvestre en presencia de PTZ.

Por lo tanto, el ensayo con PTZ también podría utilizarse para distinguir entre estas clases de mutantes de transmisión sináptica, que son ambos hipersensibles al Alde carb. En resumen, un enfoque complementario con los ensayos de PTZ y Alde carb debería permitir a un investigador caracterizar mutantes de transmisión sináptica en C. elegans de una manera que sería imposible con cualquiera de los fármacos por separado. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.