La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Hola, soy Randall Hoffman, estudiante de posgrado en el Laboratorio Susan Linus en el departamento de biología del MIT. Hoy os voy a presentar el detergente semi desnaturalizante agro rosa, electroforesis en gel, o SDD age. Nuestro laboratorio utiliza esta técnica para detectar priones y otras proteínas alogénicas.

Nuestra versión de SDD age es simple y confiable y se puede escalar para acomodar cualquier número de muestras. Los amiloides son excepcionalmente resistentes a la desnaturalización por SDS, lo que les permite separarse de otras proteínas mediante SDDH. Sin embargo, los datos de SDDH no se pueden utilizar por sí solos para confirmar que algo es amiloide.

Para ello, es necesario utilizar otras técnicas. Con eso en mente, déjame mostrártelo. S-D-D-H-S-D-D-H se puede realizar utilizando equipos estándar para la electroforesis horizontal de ADN.

Primero, debe ensamblar la bandeja de fundición de gel. El tamaño del aparato dependerá de la cantidad de muestras que tenga. Para un gran número de muestras, utilizamos una losa de 20 por 24 centímetros y hasta cuatro peines de 50 pocillos.

Para preparar el gel, necesitará gel de fuerza media o alta baja, EEO agros, un tampón XTAE y una solución de stock al 10% de SDS Make una solución 1.5%AROS y un XTAE. Querrá hacer que el gel sea lo más espeso posible para que pueda cargar la mayor cantidad de muestra y maximizar la detección. Calienta la mezcla en el microondas hasta que el aros se disuelva por completo.

Agregue rápidamente el caldo de 100 XSDS al 0.1% y revuelva para mezclar. Si algún agro se solidifica durante este paso, rojo, disuélvalo en una placa caliente. Ten cuidado de no dejar que hierva.

Después de agregar SDS, ya que la solución burbujeará fácilmente, vierta esta solución en la bandeja de fundición mientras aún está caliente. A continuación, utilice un peine para eliminar las burbujas que puedan interferir más adelante durante la transferencia del gel. Después de que el gel se haya enfriado y solidificado por completo, retire con cuidado los peines y coloque el gel en el tanque.

Sumerja completamente el gel en un XTAE con 0.1% SDS. Ahora está listo para cargar sus muestras. Las muestras de proteínas utilizadas en SDDH se preparan como en una página de SDS, con dos excepciones importantes.

En primer lugar, debe evitar calentar las muestras, ya que podría desnaturalizar los agregados en monómeros de proteínas. En segundo lugar, tenga cuidado de evitar la degradación de las proteínas. Debido a que las condiciones desnaturalizantes utilizadas aquí no son suficientes para inactivar todas las proteasas, recomendamos usar al menos el doble de la concentración recomendada de un cóctel completo de inhibidores de proteasas.

En esta demostración, usaremos lisados de células de levadura que están sobreexpresando una proteína particular de interés. Por lo general, usamos dos mil durante la noche. Los cultivos se cultivan en 96 bloques de pozos disponibles en VWR, pero cuando se analizan proteínas de baja abundancia, se deben utilizar volúmenes de cultivo más grandes.

Recolectar las células centrifugando el cultivo a 2000 RCF durante cinco minutos a temperatura ambiente después de la centrifugación, eliminar el supra nadante y lavar las células con Resus suspendiéndolas en agua y centrifugando nuevamente después del segundo centrifugado, eliminar el sobrenadante y resinar las células en solución de recubrimiento de repuesto. El zy en la solución digiere las paredes celulares, lo que le permitirá liar las células de manera eficiente y un pequeño volumen de tampón de lisis. Incubar durante 30 minutos a 30 grados centígrados.

Granule las celdas de plástico de repuesto, esta vez a 800 RCF durante cinco minutos. Retire el sate por completo y vuelva a suspender cada pellet y 100 microlitros de tampón de lisis. A continuación, cubra el bloque con cinta adhesiva y vórtice a alta velocidad durante dos minutos.

Esto ayuda a todos los plásticos de la esfera a LY P a eliminar los desechos celulares a 4.000 RCF. Durante dos minutos. Transfiera con cuidado la S natin a una placa de PCR de 96 pocillos.

Por lo general, analizamos cientos de muestras a la vez en nuestro laboratorio, por lo que para ayudarnos con esto hay un sistema de manejo de líquidos. Si lo desea, determine la concentración de proteínas de los lisados. A continuación, agregue cuatro x tampón de muestra a las muestras para generar lisados que contengan una x tampón de muestra para incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Ahora cargue las muestras en el gel. Si lo desea, guarde la mitad de los ejemplos para el análisis de página SDS. Además, cargue marcadores de peso molecular, incluidos los marcadores preteñidos y un marcador de peso molecular muy alto, como el extracto de flector de pollo.

Si lo desea, es importante mantener el gel fresco para evitar la difusión de proteínas de bajo peso molecular, por lo que es posible que desee ejecutarlo en la cámara frigorífica. Haga funcionar el gel a bajo voltaje, menos de tres voltios por centímetro de la longitud del gel. Deje pasar el gel durante varias horas hasta que el diámetro alcance aproximadamente un centímetro del extremo del gel.

Debido a que el amiloide no se desnaturaliza con un 2% de SDS a temperatura ambiente, permanecerá intacto mientras que otros complejos, incluidos la mayoría de los agregados no amiloides, se disocian en presencia de un 2% de SDS. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas serán monoméricas y correrán rápidamente a través del gel. Mientras que los amiloides de alto peso molecular resistentes al SDS migrarán más lentamente.

Después de esto, el gel estará listo para la transferencia. Aunque se pueden utilizar múltiples métodos de transferencia, obtenemos los mejores resultados utilizando la transferencia capilar. Dado que la transferencia capilar puede acomodar cualquier tamaño de gel, es práctico analizar cientos de muestras en la transferencia capilar.

Una pila de papeles secantes secos actúa para extraer tampón a través del gel, depositando proteínas en una membrana de nitrocelulosa colocada entre los papeles y el gel. Tendrás que cortar un trozo de nitrocelulosa, como C de alta adhesión, de las mismas dimensiones que el gel. También tendrás que cortar 20 trozos de papel secante GBO oh cuatro y ocho trozos de papel secante GBO oh dos del mismo tamaño que el gel.

GB oh four es muy grueso y absorbente. Mientras que GBO oh two es mucho más delgado y tiene una textura más fina, lo que garantiza un contacto más uniforme con la membrana. Corta un trozo adicional de GBO oh four para usarlo como mecha y hazlo unos 20 centímetros más ancho que el gel sumergido.

El nitroso UL WIC y cuatro piezas de GBO oh dos y un XTBS en un recipiente de plástico ensamblan una pila de papeles de la siguiente manera, 20 piezas de GBO seco oh cuatro. Luego, cuatro piezas de GBO seco, oh dos. Luego, una pieza de GBO pre humedecida oh dos.

Coloque la nitrocelulosa encima de esta pila. Enjuague brevemente el gel de la bandeja de fundición con agua para eliminar el exceso de tampón de carrera. Luego, comience a deslizar con cuidado el gel de la bandeja hacia la pila mientras desliza el gel de la bandeja y cubre la membrana con TBS según sea necesario.

El tampón adicional ayuda a evitar que las burbujas queden atrapadas en el gel. La pipeta de transferencia funciona bien para este propósito después de que el gel se haya movido completamente a la pila. Revise minuciosamente si hay burbujas, si las hay.

Levanta el borde del gel y vuelve a aplicar el tampón hasta que se puedan eliminar las burbujas. Coloque las tres piezas restantes de GBO oh oh prehumedecidas encima del gel. Asegure un contacto completo entre todas las capas enrollando una pipeta firmemente por la parte superior de la pila.

Flanquee la pila de transferencia con dos bandejas elevadas que contengan TBS que cubran la mecha prehumedecida a través de la pila, de modo que cualquiera de los extremos de la mecha quede sumergido. En TBS, cubra la pila de transferencia ensamblada con una bandeja de plástico adicional que soporte peso adicional, como una botella de agua de 500 mil. La mecha extraerá un tampón de las bandejas y los papeles secantes secos extraerán el tampón a través del gel en el transcurso de varias horas.

Esto depositará las proteínas en la membrana, permitiendo que la transferencia continúe durante un mínimo de tres horas o toda la noche. Una vez completada la transferencia capilar, la membrana puede ser procesada por Western blot estándar. Aquí se ve una mancha típica de proteínas que se sobreexpresaron en una cepa de levadura que predispone a ciertas proteínas a formar amiloide.

Se puede ver claramente que algunos de nuestros candidatos forman especies resistentes al amiloide o al SDS de alto peso molecular muy bien como las que se muestran aquí y aquí. Otros, sin embargo, no forman agregados y son completamente monoméricos, como estos y estos. Además, se puede ver que el tamaño de los polímeros amiloides difiere en función de la proteína, que se puede ver en estos dos carriles.

Acabamos de mostrarle un método simple para analizar agregados insolubles de alto peso molecular, como los amiloides de los priones candidatos. Esperamos que hayas disfrutado viendo nuestra presentación y encuentres útil esta técnica y los estudios de las proteínas inmunogénicas de Amy. Gracias por mirar y buena suerte con tu investigación.