Name: La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a detectar polímeros amiloides con SDD-AGE, una técnica electroforética escalable para cribado de priones y proteínas alogénicas en muestras de gran volumen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Simon Alberti para obtener ayuda con el desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (GM25874), Médico Howard Hughes Investigatorship Instituto (de SL), y una beca de la Fundación Nacional de Ciencia formación predoctoral (con HR).

<html> Parte 1: Preparación del gel <ol><li> Montar la bandeja de fundición de gel. El equipo estándar para la electroforesis de ADN horizontal se puede utilizar. Para un gran número de muestras, nos preparamos a 20 cm x 24 cm losa con un máximo de cuatro de 50 y peines. Asegúrese de que la losa no tiene arañazos, ya que pueden distorsionar la imagen blot. </li><li> Crear una solución de agarosa 1,5% (medio o alto gel resistencia y bajo EEO) en 1X TAE. El volumen debe ser suficiente para sumergir completamente los dientes del peine - que se desea cargar de la muestra tanto como sea posible para maximizar la detección. Microondas la mezcla hasta que la agarosa se disuelva por completo. </li><li> Suma rápida SDS al 0,1% de una reserva de 10%. Agitar para mezclar. Si algunos de agarosa solidifica durante este paso, disolver con un plato caliente y tener cuidado para evitar una ebullición. </li><li> Vierta la solución en la bandeja de fundición. Utilice un peine de rastrillo de las burbujas, ya que más tarde podrían interferir con la transferencia. </li><li> Después de gel, quite los peines y colocar el gel en el depósito de gel. Sumerja completamente el gel en 1X TAE conteniendo 0,1% SDS. </li></ol> Parte 2: Preparación de muestras <ol><li> De alto rendimiento para el análisis de los lisados ​​de levadura, se inicia con las culturas de 2 ml crecido durante la noche con agitación rápida en 96 pozos bloques. En este caso, cada cultura es una sobreexpresión de la proteína de interés. Al analizar las proteínas de baja abundancia, grandes cantidades de cultivos debe ser utilizado </li><li> Las células de la cosecha por centrifugación a 2000 rcf durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Resuspender las células en el agua y se centrifuga de nuevo. </li><li> Resuspender en 1 ml de solución spheroplasting. Se incuba durante aproximadamente 30 minutos a 30 ° C (se puede confirmar la eficiencia spheroplasting por microscopía). </li><li> Centrifugar a 800 RCF durante 5 min a temperatura ambiente. Eliminar completamente el sobrenadante. </li><li> Resuspender esferoplastos pellets en 100 ml de solución amortiguadora de lisis. </li><li> Cubrir el bloque con la cinta y el vórtice de alta velocidad durante 2 min. </li><li> Precipitado celular escombros en 4000 rcf durante 2 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante a un nuevo contenedor, por ejemplo, una placa de 96 pocillos PCR. </li><li> Si lo desea, determinar la concentración de proteínas de los lisados. </li><li> Añadir la muestra de amortiguación 4X a las muestras para generar lisados ​​que contienen 1X tampón de la muestra. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Carga de gel. Si lo desea, guarde la mitad del volumen de la muestra y hervir durante análisis SDS-PAGE. Con el fin de monitorear el grado de transferencia más adelante, incluye un pre-SDS-PAGE teñido marcador. Además, un marcador de peso molecular que consiste en proteínas de gran tamaño (por ejemplo, pollo pectoral extracto) se puede utilizar para calcular los tamaños de los complejos de resolver. </li><li> Funcionar a baja tensión (≤ 3 V / cm la longitud del gel) hasta que el frente tinte alcance aproximadamente 1 cm del extremo del gel. Esto puede durar varias horas. Es importante que el gel de mantener la calma, de lo contrario la difusión de proteínas de bajo peso molecular (por ejemplo, los monómeros) puede limitar su detección. </li></ol> Parte 3: Transferencia <ol><li> Corte un pedazo de nitrocelulosa de las mismas dimensiones que el gel. </li><li> Cortar 20 piezas de GB004 y GB002 8 piezas de papel secante, con las mismas dimensiones que el gel. Cortar una pieza adicional de GB004 para ser utilizado como una mecha, que sea de unos 20 centímetros más ancho que el gel. </li><li> Sumergir las tiras de nitrocelulosa, mecha, y 4 piezas de GB002 en 1X TBS. </li><li> En un recipiente de plástico, reunir a un montón de papeles de la siguiente manera: 20 piezas de seco GB004, a continuación, cuatro piezas de GB002 seco, luego un trozo de pre-mojado GB002. Coloque las tiras de nitrocelulosa en la parte superior de la pila. </li><li> Enjuague el gel en la bandeja de fundición brevemente en agua para eliminar el exceso de tampón en funcionamiento. Entonces, cuidadosamente comenzar a deslizar el gel de la bandeja en la pila. Mientras desliza el gel de la bandeja, apagar la membrana con TBS según sea necesario. El buffer adicional ayuda a prevenir burbujas de quedar atrapados en el gel. Una pipeta de transferencia que funciona bien para este propósito. </li><li> Después de que el gel ha sido movido a la pila, revise si hay burbujas. Si están presentes, levantar el borde del gel y volver a aplicar buffer hasta que las burbujas pueden ser resueltos. </li><li> Puesto que los tres restantes pre-humedecida GB002 piezas en la parte superior del gel. Asegurar el contacto completo entre todas las capas de rodadura de una pipeta con firmeza en la parte superior de la pila. </li><li> El flanco de la pila de transferencia con dos bandejas que contienen elevados TBS. Coloque la mecha que ya húmedo en toda la pila de tal manera que cada extremo de la mecha se sumerge en TBS. </li><li> Cubra la pila de la transferencia de ensamblado con una bandeja de plástico adicionales que soportan el peso extra (por ejemplo, una botella de 500 ml de agua). </li><li> Permitir la transferencia de proceder por un mínimo de tres horas, o toda la noche. </li><li> Después de la transferencia, la membrana puede ser procesado por la norma de Western Blot. </li></ol> Solución Spheroplasting 1,2 M D-sorbitol 0,5 mM de MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (añadir nuevo) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (añadir nuevo) coration: underline; &quot;&gt; Tampón de lisis 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (añadir nuevo) inhibidores de la proteasa (añadir nuevo) Muestra de amortiguación 4X 2X TAE 20% de glicerol 8% SDS azul de bromofenol a la preferencia

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE se informó por primera vez por Kryndushkin et al. 1, para el estudio de SDS-resistente a los complejos de la [PSI +] priones de levadura, y desde entonces ha encontrado un uso generalizado, tanto el estudio de priones y no agregados de priones 2-9. Sin embargo, la transferencia de las proteínas a una membrana de electroforesis siguiente en un gel de agarosa es problemático, y puede resultar en una imagen distorsionada mancha 5. Además, la técnica sumergida electroblotting más utilizado presenta limitaciones prácticas para el tamaño del gel y por lo tanto el número de muestras que pueden ser procesados. Hemos abordado estos problemas mediante el empleo de la transferencia a la baja capilar 10, un procedimiento simple que utiliza una pila de papeles secantes secos para la transferencia de las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa. Transferencia capilar evita la distorsión y permite que los geles grandes para ser procesado fácilmente. Hay algunas cosas a considerar antes de usar SDD-AGE. Para las muestras de crudo (por ejemplo, lisados), inmunodetección de proteínas específicas es necesario. SDD-AGE no es totalmente desnaturalizar los complejos de proteínas de interés, por lo que la proteína (s) para ser detectados deben llevar una etiqueta de epítopo fuera de la región amiloidogénica. Lisados ​​general, se puede preparar como se haría para un normal SDS-PAGE, con dos diferencias importantes. En primer lugar, un mayor cuidado se debe tomar para evitar su degradación por proteolisis. Las condiciones parcialmente desnaturalizantes utilizados aquí no son suficientes para inactivar las proteasas, y también puede hacer las proteínas diana más susceptibles a la proteólisis. Use un cóctel de inhibidores de proteasa completa en al menos dos veces la concentración recomendada. En segundo lugar, el calentamiento de la muestra debe ser evitado. Si un control de monómero de todos los negativos que se desea, por ejemplo, para confirmar que el alto peso molecular de especies no se deben a modificaciones covalentes, de una incubación de 10 minutos a 95 ° C se puede utilizar, lo que restaurará la mayoría de los amiloides de la proteína monomérica.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasas Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulosa Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>Papel para transferencia GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>Papel para transferencia GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de la agregación amiloide de semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Agregación amiloide se asocia con numerosas patologías mal plegamiento de proteínas y es la base de las propiedades de los priones infecciosos, que se auto-conformación de plantillas de las proteínas que se cree que tienen un papel beneficioso en los organismos inferiores. Amiloides han sido muy difíciles de estudiar debido a su insolubilidad y la heterogeneidad estructural. Sin embargo, la resolución de los polímeros de amiloide en función del tamaño y la insolubilidad de detergente ha sido posible gracias a Semi-desnaturalización de detergente-geles de agarosa (SDD-AGE). Esta técnica es encontrar amplio uso para la detección y caracterización de variantes conformacionales de amiloide. Este sentido, demuestran una adaptación de esta técnica que facilita su uso en aplicaciones a gran escala, como las pantallas de los priones y otras proteínas novela amiloidogénica. El nuevo SDD-AGE método utiliza la transferencia capilar para una mayor fiabilidad y facilidad de uso, y permite a cualquier tamaño de gel para ser acomodados. Por lo tanto, un gran número de muestras, preparadas a partir de células o proteínas purificadas, se pueden procesar simultáneamente la presencia de SDS-insoluble conformadores de proteínas etiquetadas.

SDD-AGE es una técnica útil para la detección y caracterización de polímeros como el amiloide en las células. Aquí se demuestra una adaptación que hace que esta técnica susceptible de aplicaciones a gran escala.

La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

La agregación amiloide se asocia con numerosas patologías por plegamiento incorrecto de proteínas y subyace a las propiedades infecciosas de los priones, que son...

Hola, soy Randall Hoffman, estudiante de posgrado en el Laboratorio de Susan Linus del departamento de biología del MIT. Hoy les voy a presentar la electroforesis en gel con detergente semidesnaturalizante, o SDD-AGE. Nuestro laboratorio utiliza esta técnica para detectar priones y otras proteínas alo génicas.Nuestra versión de la edad SDD es sencilla y confiable, y puede ampliarse para acomodar cualquier número de muestras. Los amiloideos son excepcionalmente resistentes a la desnaturalización por SDS, lo que permite separarlos de otras proteínas mediante SDDH. Sin embargo, los datos obtenidos de SDDH no pueden utilizarse por sí solos para confirmar que algo es un amiloide.Para hacerlo, es necesario utilizar otras técnicas. Con ese fin, permítame mostrarle. S-D-D-H-S-D-D-H puede realizarse utilizando equipo estándar para electroforesis horizontal de ADN.Primero, debe ensamblar la bandeja para moldear geles. El tamaño del aparato dependerá de la cantidad de muestras que tenga. Para un gran número de muestras, utilizamos una placa de 20 por 24 centímetros y hasta cuatro peines de 50 pozos.Para preparar el gel, necesitará agarosa de baja EEO con fuerza media o alta, tampón 1XTAE y una solución stock al 10% de SDS. Prepare una solución de agarosa al 1,5% y 1XTAE. Deberá hacer el gel lo más grueso posible para poder cargar la mayor cantidad de muestra y maximizar la detección. Caliente la mezcla en el microondas hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.Agregue rápidamente el stock de XSDS 100 a 0,1 % y agite suavemente para mezclar. Si algo de agros se solidifica durante este paso, caliente nuevamente en una placa calefactora para disolverlo. Tenga cuidado de no dejar que hierva.Después de agregar SDS, como la solución puede desbordarse fácilmente con burbujas, vierta esta solución en la bandeja de colado mientras aún esté caliente. Luego, utilice un peine para eliminar cualquier burbuja que pudiera interferir posteriormente durante la transferencia del gel. Una vez que el gel se haya enfriado completamente y solidificado, retire cuidadosamente los peines y coloque el gel en el tanque.Sumerja completamente el gel en un XTAE con SDS al 0,1 %. Ahora está listo para cargar sus muestras. Las muestras de proteínas utilizadas en SDDH se preparan de la misma manera que en un SDS-PAGE, con dos excepciones importantes.Primero, debe evitar calentar las muestras, ya que esto podría desnaturalizar los agregados en monómeros proteicos. Segundo, tenga cuidado para evitar la degradación proteica. Dado que las condiciones desnaturalizantes utilizadas aquí no son suficientes para inactivar todas las proteasas, recomendamos usar al menos el doble de la concentración recomendada de un cóctel completo de inhibidores de proteasas.En esta demostración, utilizaremos lisados de células de levadura que sobreexpresan una proteína particular de interés. Generalmente usamos dos ml de cultivo nocturno. Los cultivos se crecen en bloques de 96 pocillos disponibles en VWR, pero al analizar proteínas de baja abundancia, deben usarse volúmenes mayores de cultivo.Recoger las células mediante centrifugación del cultivo a 2000 RCF durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar las células resuspendiéndolas en agua y centrifugando nuevamente. Tras la segunda centrifugación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en solución de siembra fresca. La enzima en la solución digiere las paredes celulares, lo que le permitirá lisar eficientemente las células con un pequeño volumen de tampón de lisis. Incubar durante 30 minutos a 30 grados Celsius.Centrifugue las células plásticas sobrantes esta vez a 800 RCF durante cinco minutos. Retire completamente el sobrenadante y re suspenda cada precipitado en 100 microlitros de tampón de lisis. A continuación, cubra el bloque con cinta y vortexee a alta velocidad durante dos minutos.Esto ayuda a que todos los plásticos de las esferas LYP salgan junto con los restos celulares a 4.000 RCF durante dos minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a una placa PCR de 96 pocillos.Típicamente, analizamos cientos de muestras a la vez en nuestro laboratorio, por lo que para ayudarnos con esto utilizamos un sistema de manipulación de líquidos. Si se desea, determine la concentración de proteína de los lisados. A continuación, agregue tampón de muestra 4x a las muestras para generar lisados que contengan tampón de muestra 1x e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.Ahora cargue las muestras en el gel. Si se desea, guarde la mitad de las muestras para el análisis por electroforesis SDS-PAGE. Además, cargue marcadores de peso molecular, incluyendo marcadores preteñidos y un marcador de peso molecular muy alto, como el extracto de flector de pollo.Si se desea, es importante mantener el gel frío para evitar la difusión de proteínas de bajo peso molecular, por lo que puede ser conveniente hacerlo correr en una cámara fría. Haga correr el gel a baja tensión, inferior a tres voltios por centímetro de longitud del gel. Corra el gel durante varias horas hasta que el frente de tinte alcance aproximadamente un centímetro del extremo del gel.Dado que el amiloide no se desnaturaliza con SDS al 2 % a temperatura ambiente, permanecerá intacto mientras que otros complejos, incluyendo la mayoría de agregados no amiloides, se disocian en presencia de SDS al 2 %. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas serán monoméricas y migrarán rápidamente a través del gel. Mientras que los amiloides de alto peso molecular resistentes al SDS migrarán más lentamente.Después de esto, el gel estará listo para la transferencia. Aunque se pueden usar múltiples métodos de transferencia, obtenemos los mejores resultados utilizando la transferencia capilar. Dado que la transferencia capilar puede acomodar cualquier tamaño de gel, es práctico analizar cientos de muestras mediante transferencia capilar.Una pila de papeles absorbentes secos sirve para extraer el tampón a través del gel, depositando las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa colocada entre los papeles y el gel. Deberá cortar un trozo de nitrocelulosa, como la marca High Bond C, con las mismas dimensiones que el gel. También necesitará cortar 20 piezas de papel absorbente GBO oh cuatro y ocho piezas de papel absorbente GBO oh dos del mismo tamaño que el gel.El GB oh cuatro es muy grueso y absorbente. Mientras que el GBO oh dos es mucho más delgado y tiene una textura más fina, lo que garantiza un contacto más uniforme con la membrana. Corte una pieza adicional de GBO oh cuatro para usarla como mecha y hágala aproximadamente 20 centímetros más ancha que el gel sumergido.El UL WIC nitroso y cuatro piezas de GBO oh dos y un XTBS en un recipiente de plástico arman una pila de papeles de la siguiente manera: 20 piezas de GBO oh cuatro secas. Luego, cuatro piezas de GBO oh dos secas. A continuación, una pieza de GBO oh dos previamente humedecida.Coloque la nitrocelulosa encima de este conjunto. Enjuague brevemente el gel en la bandeja de moldeo con agua para eliminar el exceso de tampón de electroforesis. Luego, comience cuidadosamente a deslizar el gel fuera de la bandeja hacia el conjunto, deslizando el gel fuera de la bandeja hacia abajo sobre la membrana con TBS según sea necesario.El tampón adicional ayuda a evitar que las burbujas queden atrapadas en el gel. La pipeta de transferencia funciona bien para este propósito después de que el gel se haya movido completamente a la pila. Revise minuciosamente en busca de burbujas, en caso de que haya alguna. Levante el borde del gel y vuelva a aplicar tampón hasta que se eliminen las burbujas. Coloque las tres piezas restantes de GBO oh dos previamente humedecidas encima del gel. Asegure un contacto completo entre todas las capas rodando firmemente una pipeta sobre la parte superior de la pila.Coloque la pila de transferencia entre dos bandejas elevadas que contengan TBS; extienda la mecha previamente humedecida a través de la pila, de modo que ambos extremos de la mecha queden sumergidos. En TBS, cubra la pila de transferencia ensamblada con una bandeja de plástico adicional que lleve un peso extra, como una botella de agua de 500 ml. La mecha extraerá tampón de las bandejas y los papeles de blotting secos arrastrarán el tampón a través del gel durante varias horas.Esto depositará las proteínas sobre la membrana; permita que la transferencia continúe durante un mínimo de tres horas o durante la noche. Una vez completada la transferencia por capilaridad, la membrana puede procesarse mediante un inmunotransferido (western blot) estándar. Aquí se observa una tinción típica de proteínas que fueron sobreexpresadas en una cepa de levadura que predispone a ciertas proteínas a formar amiloide.Puede observarse claramente que algunos de nuestros candidatos forman muy bien especies resistentes al SDS de alto peso molecular o amiloideas, como las mostradas aquí y aquí. Otros, sin embargo, no forman agregados y son completamente monoméricos, como estos y estos. Además, puede verse que el tamaño de los polímeros amiloides varía según la proteína, lo cual puede observarse en estas dos bandas.Acabamos de mostrarle un método sencillo para analizar agregados de alto peso molecular e insolubles, como los amiloideos de priones candidatos. Esperamos que haya disfrutado de nuestra presentación y que encuentre esta técnica útil para estudios de proteínas inmunogénicas de Amy. Gracias por vernos y mucha suerte en su investigación.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.

Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Este video muestra una técnica de separación de proteínas basada en poliacrilamida desnaturalizante. Esta técnica ayuda en la identificación preliminar de proteínas en función de sus pesos moleculares.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

Este video muestra la separación bidimensional de fibras amiloides basada en electroforesis con gel de agarosa y detergente semidesnaturalizante. La técnica separa los agregados polimórficos de amiloide en función de su tamaño heterogéneo.

Electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa: una técnica para separar fibras de amiloide polimórficas en función de la heterogeneidad de tamaño

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Se describen métodos sencillos para la demostración de la producción de amiloides citotóxicos después de la infección del endotelio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.

Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Este protocolo describe la extracción y visualización de proteínas agregadas y solubles de Escherichia coli después del tratamiento con un antimicrobiano proteotóxico. Seguir este procedimiento permite una comparación cualitativa de la formación de agregados proteicos in vivo en diferentes cepas bacterianas y/o entre tratamientos.

Extracción y visualización de agregados proteicos después del tratamiento de Escherichia coli con un estresor proteotóxico

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Este estudio describe métodos experimentales para caracterizar bioquímicamente el GFAP y sus mutaciones causantes de enfermedades, centrándose en el ensamblaje, agregación y modificación postraduccional de filamentos. Se analizaron proteínas GFAP de alta pureza, lo que reveló conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de Alexander que podrían proporcionar un marco para estudiar posibles objetivos terapéuticos y comprender las mutaciones y trastornos relacionados con GFAP.

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

Aprende a detectar polímeros amiloides con SDD-AGE, una técnica electroforética escalable para cribado de priones y proteínas alogénicas en muestras de gran volumen.

La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

Explorar más videos