Name: Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 47 s
Description: Aprende a cultivar células madre embrionarias humanas HuES desde stocks congelados. Este protocolo reproducible facilita investigaciones en neurociencia y biología del desarrollo con alta viabilidad celular.

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Deshielo de un stock congelado: <ol><li> Antes de descongelar las células de colores, asegurarse de que la placa MEF ya ha preparado adecuadamente es plateado y en buenas condiciones. NO trate de utilizar una placa de menos deseables, o uno que tiene más de tres días. Se recomienda que antes de la etiqueta de todos los tubos cónicos y los pozos que se utiliza. </li><li> Pre-cálidos tonos medios de comunicación a 37 ° C. HUES medios alícuota en un tubo estéril cónica para cada línea. Quitar HUES vial / s de -80 e inmediatamente sumergir la parte inferior del tubo en un baño de agua 37 ° C. Se debe tener unos 45-60 segundos antes de que las células son del 80% descongelado (pequeña porción de helado a la izquierda). </li><li> Llevar rápidamente el tubo a la campana de flujo laminar, rocíe con el 70% de alcohol, y suavemente la transferencia de células a la de pre-calentado los medios de comunicación. Girar el tubo, retire el material, y resuspender en un volumen adecuado de agua dulce, previamente calentada medios tonos. </li><li> Aspirar fuera de los medios de comunicación MEF como de muchos pozos que se le deshielo en. Rápidamente, alícuota precalentado medios HUES de nuevo en cada pocillo de la placa, teniendo cuidado de no molestar a los adjuntos MEFs. Ajuste el plato a un lado de la campana. Al igual que con MEFs, mejores resultados se obtienen si las gotas se distribuyen uniformemente sobre la placa. Cuidadosamente la placa de retorno a una incubadora a 37 ° C durante la noche para permitir que las células tonalidades para sembrar el MEFs. Cambiar los medios de comunicación ~ 48 horas después de la descongelación, en sustitución de los medios de comunicación HUES fresco. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cells+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts.</a> , 1650-1656 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este vídeo, se muestra cómo nuestro laboratorio de rutina establece un HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de una masa congelada. Este proceso es susceptible de uso general en cualquier célula de mamífero si es congelado en una solución de DMSO. Descongelación eficiente es esencial para establecer una nueva cultura de las células de tonalidades de un stock congelado, y es importante para la consistencia experimental.

HUES medios 651,5 ml DMEM KO-500 ml 6,5 ml Penstrep glutamina 6,5 ​​ml 6,5 ml AANE beta-mercaptoetanol 0.5ul KO Suero Reemplazo 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / ml final) 0,65 ml

células madre embrionarias humanas: cultura a partir de células congeladas

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado. En primer lugar, de uno a dos días de edad diez placa cm de aproximadamente una (o dos) millones de embriones de ratón irradiado células alimentadoras de fibroblastos se enjuaga con medios tonos para eliminar el suero residual y los desechos celulares, y luego los medios de comunicación HUES y se deja que se equilibre en el celular incubadora de cultivo. Un vial congelado de las células de almacenamiento a largo plazo o en el congelador de nitrógeno líquido a-80C es de origen y se sumerge rápidamente en un baño de agua 37 º C para la descongelación rápida. Las células en los medios de congelación se retira del vial y colocada en una gran cantidad de medios tonos. El gran volumen de los tonos medios de comunicación facilita la eliminación del exceso de suero y DMSO, que puede causar HUES células madre embrionarias humanas para diferenciar. Las células son suavemente se salió de la suspensión, y luego volvió a suspender en un pequeño volumen de los medios de comunicación HUES dulce que se utiliza para sembrar la placa MEF. Se considera importante que la semilla de la placa MEF añadiendo lentamente las células tonos en forma gota a gota de manera uniforme a dispersarse por todo el plato. La placa de reciente creación HUES cultura se devuelve a la incubadora durante 48 horas antes de que los medios de comunicación se sustituye, a continuación, se alimenta cada 24 horas después.

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se inicia una HUES madre embrionarias humanas de cultivo de células de línea de un stock congelado.

Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas

Aquí demostramos cómo nuestro laboratorio inicia el cultivo de una línea de células madre embrionarias humanas HuES a partir de un stock congelado. Primero, una placa de diez cm de uno a dos días de antigüedad de...

human-es-cells-starting-culture-from-frozen-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se demuestra cómo nuestro laboratorio se congela HUES de embriones humanos líneas de células madre.

Congelar las células madre embrionarias humanas

Desde James Thomson et al desarrollaron una técnica en 1998 para aislar y hacer crecer hES en cultivo, las células de congelación para su uso posterior y el deshielo y la ampliación de las células de un stock congelado se han convertido en importantes procedimientos realizados en el cultivo de rutina hES celular. Dado que las células hES son muy sensibles a las tensiones de la congelación y descongelación, debe tomar especial cuidado. Aquí se demuestra la técnica adecuada para descongelar...

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células epiteliales de amnios humano (hAECs) utilizando reactivos libres de productos animales de acuerdo con las directrices actuales de buenas prácticas de fabricación (cGMP).

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

Se presenta un protocolo para preparar polivinilos hidrogeles de ácido itacónico-co-alcohol con rigidez variable, que han sido injertadas con y sin oligopéptidos, para investigar el efecto de la rigidez de los biomateriales en la diferenciación y proliferación de células madre. La rigidez de los hidrogeles fue controlada por el tiempo de reticulación.

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

Este protocolo permite el mantenimiento de células madre hematopoyéticas humanas en reposo in vitro imitando el microambiente de médula ósea utilizando abundantes ácidos grasos, colesterol, concentraciones más bajas de citoquinas e hipoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

El protocolo actual detalla los pasos para solucionar la derivación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de muestras de pacientes que han sido difíciles de reprogramar siguiendo las instrucciones del fabricante. Este protocolo es específico para muestras congeladas de capa buffy, pero también puede aplicarse a la reprogramación de PBMCs purificados.

Reprogramación de líneas de células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras congeladas de capa buffy

Aprende a cultivar células madre embrionarias humanas HuES desde stocks congelados. Este protocolo reproducible facilita investigaciones en neurociencia y biología del desarrollo con alta viabilidad celular.

Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas

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