Name: Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Aprende la hibridación in situ de montaje doble en embriones de pollo temprano para visualizar patrones de expresión génica simultánea. Este método permite estudiar interacciones genéticas en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.

Parte 1: La fijación de los embriones <ol><li> Rellene plato disección con helada DEPC PBS. Mantener en hielo. Abrir el huevo tocando la concha con una pinza y retirar pedazos de la cáscara. </li><li> Eliminar la albúmina de espesor con pinzas. Inclinación del saco vitelino con pinzas gruesas para que el embrión hacia arriba. </li><li> Con la tijera, cortar un cuadrado de alrededor del saco vitelino del embrión. </li><li> Usando una cuchara, retire embrión a partir de yema de huevo y colocar en hielo frío DEPC PBS. </li><li> Bajo el microscopio, retire las membranas y la yema y traslado al plato de fijación. </li><li> Precisar, eliminar DEPC PBS. Reemplazar con PFA al 4% en PBS con DEPC y fijar O / N a 4 ° C. </li><li> Eliminar el fijador. Vuelva a colocar con helada DEPC PBS. Utilizando una aguja de punta roma microcapilar o un cuchillo de microdisección, perfore el sistema nervioso y las cavidades del corazón, para evitar la captura de la sonda. </li><li> Lavar 2 veces 10 minutos con DEPC PBS con 0,1% de Tween-20 (PBT). Deshidratar 10 minutos cada uno en el 25%, 50%, 75% de metanol en PBT. Deshidratar los embriones en dos ocasiones en metanol al 100%. Almacenar a -20 ° C en metanol. </li></ol> Parte 2: prehibridación <ol><li> Rehidratar embriones 10 minutos cada uno en el 75%, 50% y 25% de metanol en PBT. Lavar 2 veces 10 minutos en PBT. </li><li> Mientras tanto, prepare fijador fría (4% de paraformaldehído en PBT). Vuelva a colocar PBT con proteinasa K solución (3 ml / vial; [? 5 g / ml] final en PBT). Asegúrese de que el vial está expuesto a una solución de proteinasa K por suaves ondulaciones del vial, consulte Solución de problemas para los tiempos de exposición. </li><li> Utilizando RNasa libre pipeta Pasteur eliminar proteinasa K y añadir el fijador (2 ml). Colocar inmediatamente en hielo durante exactamente 20 minutos. </li><li> Todos los lavados se llevan a cabo en la RT nutator. Lavar 2 veces 10 minutos en el PBT, y 1x 10mn en PBT con 50% de tampón de hibridación. </li><li> Lavado 1X en tampón de hibridación. Se incuba a 65 ° C en 2 ml de tampón de hibridación 05.04 horas. </li></ol> Parte 3: embriones híbridos con sondas <ol><li> DIG y FITC síntesis de la sonda unida se describe en el Apéndice. La sonda de espera para dar una señal fuerte, debe ser synhesized con FITC-que contiene nucleótidos, la sonda más débiles deben ser sintetizados con con DIG-que contiene los nucleótidos. </li><li> Precaliente sondas de hibridación de amortiguación (500 ng / ml cada una) mediante un vial de 2 ml. Rápidamente reemplazar el tampón de hibridación con la solución de la sonda. No deje que los embriones seco. Incubar durante 16 horas a 65 ° C. </li><li> Vuelva a colocar la sonda con el tampón de hibridación, lavados de 2, 30 mn cada uno a 65 ° C. Lavado de 15 minutos en tampón de hibridación / MABT (1 / 1 v / v /) a 65 ° C. </li></ol> Parte 4: incubación DIG anticuerpos y la reacción de color <ol><li> Lave 2x20 mn en MABT. Lavado de 1 hora en el 2% BBR / MABT. Lávese las 5 horas en el 2% BBR/20% HISS / MABT (tampón de bloqueo). Incubar en 1:2000 de anticuerpos DIG diluido en tampón de bloqueo, O / N a 4 ° C en nutator. </li><li> Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT. </li><li> Lavar 2 veces 20 minutos en NTMT. Añadir 200ul NBT / BCIP sustrato NTMT de 10 ml. Quitarse de inmediato NTMT de vial y reemplazar con 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 20 minutos y, posteriormente, a intervalos de 20 mn. </li><li> Tras la reacción de color (azul debe aparecer), lavar en PBS durante 10 minutos, de precisar en un plato lleno de fijación con PBS, y reemplazar la solución con 4% PFA en PBS. Fix O / N a 4 ° C. </li><li> Traslado al nuevo vial de centelleo. Lave en PBST (PBS con 1% de Tween-20) 2x10 mn. Lave en MABT 2x 10 mn. </li><li> Incubar en MABT 30 minutos a 63 ° C. </li></ol> Parte 5: incubación de anticuerpos FITC y color de la reacción <ol><li> Lavar 2 veces 10 minutos en MABT, 1 hora en el 2% BBR / MABT, 5 horas en tampón de bloqueo </li><li> Incubar en la fosfatasa alcalina-junto anti-FITC-anticuerpo (1:500) O / N a 4 ° C. </li><li> Lave 3 veces cada 10 minutos en MABT, y 3x 1 hora cada uno en MABT. </li><li> Lave en 2x 20 minutos en TBS pH 8,45, con 0,1% de Tween-20 (TBST). </li><li> Prepare una solución vectorial Red de trabajo (5 ml) en TBST utilizando reactivos 1,2 y 3 incluye en el kit. Quitarse de inmediato la TBST de vial y reemplazar con el vector de búfer Roja. Lugar en la oscuridad. Monitorear la reacción de color después de 40 minutos, y en intervalos de 30 mn a partir de entonces. </li><li> Tras la reacción de color (deben aparecer de color rojo), los embriones de transferencia de PBS. </li></ol> Parte 6: La fijación y el procesamiento <ol><li> Traslado al plato de fijación que contiene PBS, y fijar en PFA al 4% durante 20 min a temperatura ambiente o S / N a 4 ° C. </li><li> Se lavan con PBS, 2 veces 10 minutos. Para el proceso de la fotografía, la transferencia y el 20% de glicerol en PBS (esto hará que los embriones transparentes). Para crear una cámara, cortar dos tiras de cinta de PVC, superponerlos en la diapositiva. Corte un cuadrado en el centro con una cuchilla. Retire las pinzas cuadrados utilizando. </li><li> Para el proceso de corte de cera, traslado de regreso a la PBS, lavar 2 veces 10 minutos, deshidratar en serie gradual de metanol (25%, 50%, 75% y 100% en PBS, a 10 minutos cada uno). </li><li> Reemplazar con propanol, 3 millones. Reemplazar con 1,2,3,4-tetrahidronaftaleno, a 20 minutos seguido por Histoclear (2x 1 hora). Reemplazar con histoclear / cera 1 / 1 (v / v) 60 ° C durante 1 hora. Vuelva a colocar la cera de un procesode la histología. </li></ol> Parte 7: Soluciones Tampón de hibridación, almacenar a -20 ° C en Falcón, 50 ml: 25 ml de formamida, 3.25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% de Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) , 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 mg / ml de heparina) MABT, preparar ácido maleico 100 mM, pH de 7,5 con NaOH pellets. Añadir 150 mM NaCl y 0,1% Tween-20. NTMT (hace justo antes de su uso), 50 ml: 1 ml (5M NaCl) 2,5 ml (2 M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2 M MgCl 2), 5 ml (10% de Tween-20). TBST: 0,1 M Tris-HCl, NaCl 0,15 M, pH 8,45, 0,1% Tween-20. Parte 8: Solución de problemas <table border="1"><tbody><tr><th> Problema </th><th> Causa </th><th> Remedio </th></tr><tr><td valign="top"> Embrión es un ovillo </td><td valign="top"> Deshidratación insuficiente / rehidratación </td><td valign="top"> Mantener intervalos de 10 mn durante los sucesivos deshidratación / rehidratación pasos </td></tr><tr><td valign="top"> No hay ninguna señal de la sonda </td><td valign="top"> La sonda se degrada la contaminación RNasa en vial </td><td valign="top"> Ejecutar la sonda en un 1% en gel de agarosa Asegúrese de que el vial está expuesto a la proteinasa K solución en el paso 2 </td></tr><tr><td valign="top"> La sonda está etiquetas cavidades del corazón de un tubo neural </td><td valign="top"> La sonda está atrapado </td><td valign="top"> En el paso 2, asegúrese de que todas las cavidades están perforadas con un cuchillo o microdisección microcapilar </td></tr><tr><td valign="top"> Embrión se desintegró después de la hibridación (paso 3) </td><td valign="top"> Proteinasa K paso a la izquierda la temperatura de hibridación demasiado tiempo es demasiado alto </td><td valign="top"> Proteinasa K no se debe dejar más de 1 millón de (etapas 3 + y 4), 2 mn (fase 5 a 7), 3 mn (fase 8-10), 4 mn (etapa 11-13) no hibridan en T o superior de 65 º C </td></tr></tbody></table> Parte 9: Resultados de Representante Embriones representativos se muestran a continuación: (A) embrión (fase HH7) está marcado con una sonda DIG-Medias (azul) y FITC-delta-1 de la sonda (rojo). (B) embrión (fase HH8) está marcado con una sonda DIG-Pax6 (azul) y una sonda FITC-Shh (rojo). NF, de los nervios veces, la ANP, la placa neural anterior, psm, mesodermo presomitic, n, notocorda, nt, del tubo neural). Regalos de la sonda de los laboratorios de los doctores. C. Tabin, M. Goulding, Henrique D., y J. Briscoe. <img src="/files/ftp_upload/old/904_2008_10_20_1/904_Figure-01.png" alt="" width="303" height="300" />

<ol><li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. 406, 74-78 (2000).</li>
<li>Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+Cer-like+protein+Caronte+mediates+the+establishment+of+embryonic+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry.</a> Nature. 401, 243-251 (1999).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
<li>Kawakami, M., Nakanishi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+an+endogenous+PKA+inhibitor%2C+PKIalpha%2C+in+organizing+left-right+axis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation.</a> Development. 128, 2509-2515 (2001).</li>
<li>Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Todo el monte de 2 colores en el método de hibridación in situ se utiliza para determinar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica, utilizando uno o dos genes de interés. Las aplicaciones incluyen la evaluación de patrones de expresión génica de los genes de la novela (por ejemplo, 1,2, así como los cambios en la expresión génica insulto siguientes (manipulaciones embrionarias 3, 4 bolas, y la electroporación de ARN o ADN construye 5).

<table><tbody><tr><td>Huevos</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fértil</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscopio</td><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora automática Marsh</td><td>Herramienta</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de hibridación</td><td>Herramienta</td><td>Hybaid</td><td>Micro-4</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador orbital Adams Nutator</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-062</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas (1)</td><td>Herramienta</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>Cucharilla</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta capilar Pasteur</td><td></td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcapilar</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td>Tirar usando un tirador vertical de micropipetas; romper el extremo con pinzas finas</td></tr><tr><td>Cuchillo de microdisección</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Usar para perforar cavidades antes de la hibridación in situ</td></tr><tr><td>Alfileres Minuten, diámetro 0,2 mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Mantener los alfileres juntos usando un agitador magnético;</td></tr><tr><td>Agente de curado y base de elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Reactivo</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>Mezclar 1 parte de agente de curado con 9 partes de base; dejar toda la noche a 37 °C</td></tr><tr><td>Diethylpirocarbonato (depc)</td><td>Reactivo</td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>Añadir 1 ml de depc a 1 l de PBS; agitar; autoclavar</td></tr><tr><td>PFA al 16%</td><td>Reactivo</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5MG</td><td>Preparar stock a 10 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 10 µl. Almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Reactivo</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>tRNA de levadura - 25 mg</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15401-011</td><td>Preparar stock a 20 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 125 µl. Almacenar a -20 °C</td></tr><tr><td>Heparina, sal sódica</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>Preparar stock a 50 mg/ml en depc-H₂O en alícuotas de 100 µl. Almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>SSC x20 pH 5,5</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V4261</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>PR-V4231</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Reactivo</td><td>Fluka</td><td>63189</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante B&amp;#8211;hringer</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Usar al 2% en MABT. Para prepararlo, calentar con MABT durante 20 min a 60 °C. Puede prepararse un stock y almacenarse en alícuotas de 1-5 ml a 20 °C.</td></tr><tr><td>Suero de oveja inactivado por calor</td><td>Reactivo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>013-000-121</td><td>Disolver en 10 ml de H₂O; calentar a 55 °C durante 30 min. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Solución stock de NBT/BCIP</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fluoresceína-AP, fragmentos Fab</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Tris 2 M</td><td>BP1759-500</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de sustrato de fosfatasa alcalina Vector Red</td><td>Reactivo</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>1,2,3,4-tetrahidronaftaleno</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429325-100ML</td><td>Bajo campana extractora</td></tr></tbody></table>

monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo hacen una herramienta ideal para estudiar la expresión génica en el cerebro, tubo neural, somite y la formación de primordios corazón. Este video muestra los diferentes pasos en el monte de 2 colores toda la hibridación in situ, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. En segundo lugar, el embrión se procesa para prehibridación. El embrión se hibrida con dos sondas diferentes, una junto a la DIG, y un acoplado a FITC. Tras la hibridación noche a la mañana, el embrión se incuba con anticuerpo acoplado DIG. Reacción de color de sustrato DIG se lleva a cabo, y la región de interés se ve azul. El embrión se incuba con anticuerpos FITC acoplados. El embrión se procesa para la reacción de color con FITC, y la región de interés se ve rojo. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para phtograph y seccionamiento. Una guía de solución de problemas también se presenta.

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación lo convierten en un...

Este procedimiento comienza con la fijación, el tratamiento con metanol y proteinasa K de los embriones, seguido de una incubación nocturna con la sonda diggen o dig y sonda. Dos embriones de isotiocianato de fluoresceína o ZI se incuban con el anticuerpo dig tras la reacción cromogénica con fosfatasa alcalina dig. La actividad se inactiva y los embriones se incuban.Con el anticuerpo FSE, se realiza la reacción de color con Zi y los embriones se fijan. Hola, soy Delphine del laboratorio de Rick Finnel en el Centro de Medicina Genómica y Ambiental de la Universidad Texas A&M en Houston. Hoy les mostraremos el procedimiento para realizar una hibridación in situ de dos colorantes en el embrión de pollo.Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para analizar los efectos de los fármacos antiepilépticos sobre genes gástricos y neuronales. Comencemos. Para realizar la hibridación in situ en embriones de pollo, primero abra un huevo golpeando el cascarón con pinzas y retirando trozos del mismo. Retire el albúmino espeso con pinzas e incline la vesícula vitelina con pinzas gruesas para que el embrión quede orientado hacia arriba, utilizando tijeras finas.Corte un cuadrado de la bolsa de yema alrededor del embrión. Retire el embrión de la yema con una cuchara y colóquelo en un recipiente con hielo. PBS frío sin yema bajo un microscopio de disección. Retire cuidadosamente las membranas y la yema y transfiera el embrión a un recipiente nuevo que contenga hielo.Enfriar PBS sin yema, sujetar el embrión con pinzas y aspirar el PBS sin yema en la campana extractora. Reemplazar con paraformaldehído al 4 % en PBS sin yema y dejar que el embrión se fije durante la noche a cuatro grados Celsius. Una vez fijados los embriones, aspirar la solución fijadora y desecharla adecuadamente como residuo químico.Llene el recipiente con PBS desionizado frío con hielo utilizando una aguja microcapilar de extremo romo o perfore las cavidades cardíaca y cefálica con un bisturí para microdisección. Para evitar la retención de la sonda. Coloque los embriones en PBS desionizado que contenga 0,1 % de tween 20, luego deshidrate los embriones mediante una serie de lavados en metanol durante 10 minutos cada uno en metanol al 25 %, 50 %, 75 % y 100 % en PBT.Repita el lavado con metanol al 100 %. Los embriones pueden almacenarse ahora a menos 20 grados Celsius en metanol, en viales de vidrio de 20 mililitros.Para realizar la hibridación in situ, será necesario primero rehidratar los embriones. Para ello, lave los embriones durante 10 minutos cada uno en metanol al 75 %, 50 % y 25 % en PBT. Finalmente, lave dos veces durante 10 minutos cada uno.En PBT, retire la solución de PBT de los viales y sustitúyala por una solución de proteinasa K de cinco microgramos por mililitro. Tres mililitros por vial. Gire suavemente el vial para asegurarse de que todo su contenido entre en contacto con la solución de proteinasa K.Deje en la solución de proteinasa K de uno a cinco minutos según la etapa del embrión. Mientras tanto, prepare una solución fijadora fría con hielo utilizando una pipeta de plástico libre de ARN, retire la solución de proteinasa K y agregue dos mililitros de la solución fijadora. Coloque inmediatamente el vial en hielo durante exactamente 20 minutos.A continuación, lave los embriones a temperatura ambiente en un agitador. Realice dos lavados de 10 minutos cada uno en PBT, seguidos de un lavado de 10 minutos en tampón de hibridación al 50 % en PBT. Luego, lave una vez en tampón de hibridación al 100 % e incube los embriones en dos mililitros de tampón de hibridación durante cuatro a cinco horas.A 65 grados Celsius. Los embriones ya están listos para ser hibridados con sondas. La síntesis de sondas acopladas dig y fitzy se describe en el material de apoyo. La sonda que se espera que dé una señal fuerte debe sintetizarse con nucleótidos que contengan FSE, mientras que las sondas más débiles deben sintetizarse con nucleótidos que contengan dig.Precaliente las sondas en tampón de hibridación utilizando un vial de dos mililitros. Retire el tampón de hibridación de los embriones y reemplácelo inmediatamente por la solución de sonda. Es importante no dejar que los embriones se sequen; incube durante 16 horas a 65 grados Celsius.Después del paso de hibridación de la sonda, sustituya la solución de la sonda por tampón de hibridación. Realice dos lavados de 30 minutos a 65 grados Celsius, luego lave durante 15 minutos en una mezcla uno a uno de tampón de hibridación y tampón de ácido málico, nuevamente a 65 grados Celsius. Después de este paso, ya no necesita utilizar condiciones libres de ARN.Ahora está listo para realizar la reacción de color Dig, seguida de la reacción de color Fitz. Para llevar a cabo primero la hibridación con el anticuerpo y la reacción de color, lave los embriones dos veces durante 20 minutos cada vez con tampón de ácido málico. Luego, lave durante una hora con 2%VBR en tampón de ácido málico.Finalmente, incubar durante cinco horas en tampón de bloqueo. Diluir el anticuerpo dig en una proporción de uno a 2000 en tampón de bloqueo e incubar los embriones en esta solución sobre agitación lenta durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, realizar tres lavados de 10 minutos en tampón de ácido málico, seguidos de tres lavados de una hora en tampón de ácido málico. Lavar dos veces durante 20 minutos cada uno.En NTMT, añada 200 microlitros de sustrato N-B-T-B-C-I-P a 10 mililitros. Inmediatamente retire el NTMT del vial con el embrión y reemplácelo con uno o dos mililitros. Coloque el tampón N-B-T-B-C-I-P en la oscuridad.Observe la reacción de color después de 20 minutos y luego a intervalos de 20 minutos. Cuando el color azul se haya desarrollado adecuadamente, lave los embriones en PBS durante 10 minutos. A continuación, reemplace el PBS con paraformaldehído al 4% en PBS.Fije durante la noche a cuatro grados Celsius. Transfiera el embrión a un nuevo vial de instalación de syn y lávelo en PBT dos veces durante 10 minutos cada vez, seguido de dos lavados de 10 minutos en tampón de ácido málico. Incube los embriones en tampón de ácido málico durante 30 minutos a 65 grados Celsius.Ahora es el momento de realizar la segunda incubación con el anticuerpo y la reacción de color. Con el fin de detectar nuestra segunda sonda marcada con fits e, lave los embriones dos veces durante 10 minutos cada vez en tampón de ácido málico. Una hora en 2%BBR en tampón de ácido málico.Luego, durante cinco horas en tampón de bloqueo, diluya el anticuerpo antifitasa acoplado a fosfatasa alcalina en una proporción de 1 a 500 en tampón de bloqueo e incube los embriones en esta solución durante la noche a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente, realice tres lavados de 10 minutos cada uno en tampón de ácido málico, seguidos de tres lavados de una hora cada uno en tampón de ácido málico. A continuación, lave dos veces durante 20 minutos cada lavado.En Tris HCl, prepare cinco mililitros de solución de trabajo de rojo vector en Tris HCl según el protocolo del fabricante. Retire inmediatamente el Tris HCl del vial y sustitúyalo por el tampón rojo vector. Coloque los viales en la oscuridad.Observe la reacción de color después de 30 minutos y luego a intervalos de 30 minutos; una vez que se haya desarrollado el color rojo, transfiera los embriones a PBS. Finalmente, estará listo para fijar y procesar los embriones. Trasládelos a una placa de fijación que contenga paraformaldehído al 4% y fije durante 20 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius.Lave dos veces en PBS durante 10 minutos por lavado para preparar para la fotografía. Transfiera los embriones a glicerol al 20% en PBS. Esto hará que los embriones sean translúcidos para su procesamiento en secciones de parafina.Transfiera los embriones de nuevo a PBS y lávelos dos veces durante 10 minutos cada vez; deshidrate en una serie de metanol durante 10 minutos cada paso; sustituya el metanol por propanol e incube durante tres minutos. Retire el propanol y sustitúyalo por 1 2 3 4 tetra hidro naftalina durante 20 minutos, seguido de histo clear, dos lavados de una hora cada uno. Sustituya con una mezcla uno a uno de histo clear y parafina e incube a 60 grados Celsius durante una hora.Sustituya esta solución por parafina y procese para histología. Este embrión está marcado con un digoxigenina en socks, dos sonda en azul y una sonda fitc delta una que aparece en rojo. La primera reacción de color revela el patrón de expresión de socks.dos.Un marcador para la placa neural desarrollado en el laboratorio del Dr. Robin Level Badge muestra que las células positivas para sox dos aparecen en azul tras la reacción con N-B-T-B-C-I-P. Posteriormente, se procesa el mismo embrión para una segunda reacción de color, que revela el patrón de expresión de delta uno. Un marcador para la placa segmentaria desarrollado en el laboratorio del Dr. Domingo Enrique muestra que las células positivas para delta uno aparecen en rojo tras la reacción con vector rojo.Este embrión está marcado con una sonda digo en PAC seis en azul y una sonda fitzy SHH en rojo. La primera reacción de color revela el patrón de expresión de PAC seis, un marcador de los pliegues neurales y los somitas en desarrollo desarrollado en el laboratorio del Dr. Martin Goulding Pac. Las células positivas para PAC seis aparecen en azul tras la reacción con N-B-T-B-C-I-P.La segunda reacción de color revela el patrón de expresión del marcador SHHA para el Noor y la línea media ventral del tubo neural desarrollado en el laboratorio del Dr. Cliff Tabban. Las células positivas para SHH aparecen de color rojo, tras la reacción con vector rojo. Acabamos de mostrarle cómo realizar la hibridación con coloración doble en el embrión de pollo.Al realizar este procedimiento, es importante recordar el uso de soluciones tratadas con C de profundidad, así como la autoclave, pfas y vi estéril. Con el fin de minimizar el contacto con ARNs en los pasos tres a cinco. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Biology

Biología

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

Este video muestra todo inmunohistoquímica montaje, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de un antígeno puede ser visualizado en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

En este artículo se describe el etiquetado y la...

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar...

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación.   Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Este protocolo permite la visualización de la expresión génica en embrionario Astyanax cavefish. Este enfoque ha sido desarrollado con el objetivo de maximizar la señal de la expresión del gene, minimizando tinción de fondo inespecífica.

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

Aprende la hibridación in situ de montaje doble en embriones de pollo temprano para visualizar patrones de expresión génica simultánea. Este método permite estudiar interacciones genéticas en biología del desarrollo.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

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