Reaggregate Culturas del timo

Hola, soy Andrea White y pertenezco al laboratorio de Graham Anderson y Eric Jenkinson en el Centro MRC de Regulación Inmunológica de la Universidad de Birmingham. Hoy presento un protocolo para derivar cultivos de órganos tímicos reagregados, que se puede utilizar para estudiar las interacciones celulares complejas que ocurren durante la diferenciación de las células T. Antes del inicio de este procedimiento, se aislaron y trataron lóbulos tímicos embrionarios para eliminar todos los linfocitos.

Esto se puede ver en un video separado. A continuación, los lóbulos alienoides se desagregan para producir una preparación de células estromales. Y, por último, las células se agregan para formar un cultivo de órganos fmic reagregado.

Empecemos. Después de cinco a siete días en cultivo, el LO debe estar listo para desagregar para preparaciones de células de cardúmenes, sumerja los filtros de 0,8 micrómetros en una placa de Petri que contenga RPMI 1640 más 10% de FCS Con pinzas, empuje suavemente cualquier pendiente de fibra que no flote. Use una milésima de pulgada por mascota para transferir los lóbulos a un tubo de orph de 1.5 milésimas de pulgada.

Se recomienda no más de 50 lóbulos por tubo de orph. Deje que los lóbulos se asienten en el fondo del tubo bajo la unidad de gravedad y elimine el medio. Lave los lóbulos con una milésima de pulgada PBS y luego deje que los lóbulos se hundan hasta el fondo nuevamente.

Repita esto para un total de tres lavados de PBS, retire el último lavado de PBS y agregue 600 microlitros de una solución de 0.25%trips en la misma. Coloque el tubo einor en una incubadora a 37 grados durante 25 minutos. Tritrate suavemente los lóbulos con una punta azul de una milésima de pulgada en un perpete durante 10 segundos, y luego vuelva a colocarlos en la incubadora después de 20 minutos, pipete los lóbulos hacia arriba y hacia abajo para desagregarlos por completo.

Debería tomar alrededor de 30 segundos Para lograr una suspensión de una sola celda, agregue 400 microlitros helados, RPMI 1640 más 10% FCS para neutralizar la tripsina imp pellet de las celdas por centrifugación a mil RPM, 10 minutos a cuatro grados C, retire el sup natant y vuelva a suspender el pellet en un mil. RPMI 1640 más 10%FCS si lo desea. Contar celdas.

Por lo general, esperaríamos alrededor de 50.000 células por lóbulo de dioxazina, a partir de un E 15 fibroso. Ahora estamos listos para formar los cultivos agregados de Corgan en un tubo de un millón y medio de pulgada de diámetro. Células estromales finas mezcladas y recién preparadas.

Junto con los CD preseleccionados, cuatro CD positivos, ocho fibrocitos positivos. Recomendamos una proporción de uno a uno de células estromales con respecto a los fibrocitos. El número de celdas que utilizará dependerá del número de celdas disponibles y de los experimentos que se vayan a realizar.

Recomendamos al menos cien mil células en total y no más de 1,5 millones de células. Desea que los agregados V sean lo suficientemente grandes como para ser reproducibles, pero no tan grandes como para que el centro muera las celdas de pellets por centrifugación a mil RPM durante 10 minutos. A cuatro grados C, ensamble el filtro de cultivo de órganos con cuidado.

Retire todos los SUP natin en el escenario con un P 200 por mascota. La célula de vórtice se granula durante 10 segundos para formar una suspensión. El volumen debe ser de alrededor de uno a dos microlitros por boca.

Acaricie la lechada en una mascota finamente estirada, manteniendo la suspensión de las células en la punta de la mascota. Bajo nuestro microscopio de disección, coloque cuidadosamente la lechada de células en el centro de un filtro de 0,8 micrómetros. Idealmente, las celdas deben colocarse como una gota de pie en un círculo de uno a dos milímetros de diámetro.

Si la suspensión comienza a extenderse, permita que el líquido de la suspensión se drene a través del pos antes de depositar las células restantes. Coloque el plato en una caja de plástico para sándwiches y séllelo. En cuanto a los cultivos de órganos de timo, y colocamos una caja en una incubadora, agregamos los cultivos en estructuras intactas dentro de las 18 horas posteriores al cultivo.

Después de cuatro a cinco días de cultivo, generarán subconjuntos de citos maduros CD cuatro positivos ocho negativos y CD cuatro negativos ocho positivos. A partir de 50 lóbulos tratados con dioxazina se deben producir suficientes células estromales para preparar de tres a cinco cultivos reagregados. Estos cultivos suelen aparecer como montículos coherentes de células que pueden ser empujadas fuera de los filtros con fórceps sin alterarlas.

Acabamos de describir el método para estudiar la selección positiva por parte de las células epiteliales F. Este método también se puede utilizar para estudiar la selección negativa mediada por células dendríticas. Por último, mediante el uso de FIBROCITOS transgénicos TCR o células estromales deficientes en MHC Clase uno o MHC Clase dos deficientes.

Este sistema permite investigaciones separadas en la selección de células T CD cuatro positivas o CD ocho positivas. Gracias por sintonizarnos.