Name: Reaggregate Culturas del timo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende a preparar cultivos de timo reagregado tratados con 2-dGuo para estudiar la diferenciación de células T y las interacciones celulares en inmunología.

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Para más información sobre la preparación de las culturas reggregate timo por favor visite <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocolos Springer</a> .

Los autores no tienen nada que revelar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate culturas del timo

Reaggregate Thymus Cultures

En el timo CD4, inmaduros 8 + timocitos que expresan al azar reorganizado receptor de células T-α y la cadena de b-genes someterse a eventos de selección positiva y negativa sobre la base de su capacidad para reconocer complejos self-peptide/major de histocompatibilidad (MHC) expresadas por timo las células del estroma. En el análisis in vivo del papel de las células del estroma del timo durante la selección intratímica se hace difícil por la complejidad del microambiente celular del timo en el timo de adultos en estado estacionario, y por la falta de estrategias adecuadas de marketing para manipular la expresión génica, en particular, los compartimentos estromal tímica. Hemos demostrado que el microambiente del timo puede ser fácilmente manipulado in vitro mediante el uso de reaggregate culturas timo de órganos, que permiten la preparación de las tres dimensiones de los lóbulos del timo definido las células del estroma y linfoide. Aunque otros sistemas in vitro apoyar algunos aspectos de las células T de desarrollo, el cultivo de órganos reaggregate timo sigue siendo el único sistema in vitro capaces de soportar MHC de clase I y II eficiente mediada por eventos de selección de timocitos, y por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta eficaz para estudiar la regulación celular y molecular de la selección positiva y negativa en el timo.

En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

Reaggregate Culturas del timo

Las células estromales dentro de los tejidos linfoides se organizan en estructuras tridimensionales que proporcionan un armazón que, según se cree, controla la migración y ...

Hola, soy Andrea White y pertenezco al laboratorio de Graham Anderson y Eric Jenkinson en el Centro MRC para la Regulación Inmune de la Universidad de Birmingham. Hoy presento un protocolo para obtener cultivos organoides tímicos reagregados, que pueden utilizarse para estudiar las complejas interacciones celulares que ocurren durante la diferenciación de linfocitos T. Antes de comenzar este procedimiento, se aislaron lóbulos tímicos embrionarios y se trataron para eliminar todos los linfocitos.Esto puede observarse en un video aparte. Luego, los lóbulos alienoides se desagregan para producir una preparación de células estromales. Y finalmente, las células se agregan para formar una cultura organotípica de órganos fmic reagregados.Comencemos. Después de cinco a siete días en cultivo, el LO debería estar listo para ser disgregado para preparaciones de células en cardúmenes; sumerja los filtros de 0,8 micrómetros en una placa de Petri que contenga RPMI 1640 más 10 % de FCS. Con pinzas, empuje suavemente cualquier pendiente de fibra que no flote. Utilice una pipeta de 1 mL para transferir los lóbulos a un tubo eppendorf de 1,5 mL.Recomendamos no más de 50 lóbulos por tubo eppendorf. Deje que los lóbulos sedimenten en el fondo del tubo por gravedad unitaria y retire el medio. Lave los lóbulos con un mililitro de PBS y luego deje que los lóbulos vuelvan a sedimentar en el fondo.Repita esto para un total de tres lavados con PBS, retire el último lavado con PBS y agregue 600 microlitros de una solución al 0,25 % de tripsina. Coloque el tubo eppendorf en un incubador a 37 grados durante 25 minutos. Triture suavemente los lóbulos utilizando una punta azul de 1 ml en una pipeta automática durante 10 segundos, y luego devuélvalo al incubador; después de 20 minutos, aspire y expulse los lóbulos varias veces para desagregarlos completamente.Debe tomar aproximadamente 30 segundos. Para obtener una suspensión de células individuales, agregue 400 microlitros de RPMI 1640 frío con hielo más 10 % FCS para neutralizar la tripsina, precipite las células por centrifugación a mil RPM durante 10 minutos a cuatro grados C, elimine el sobrenadante y re suspenda el precipitado en un mililitro de RPMI 1640 más 10 % FCS si se desea. Cuente las células.Típicamente esperaríamos alrededor de 50.000 células por lóbulo de dioxazina, partiendo de un tejido fibroso E15. Ahora estamos listos para formar los cultivos agregados de fmic Corgan en un tubo orph de una milla y media. Células estromales finas mezcladas, recién preparadas.Junto con fibrocitos CD4+ CD8+ preseleccionados. Recomendamos una proporción aproximada de uno a uno entre células estromales y fibrocitos. La cantidad de células que utilizará dependerá del número de células disponibles y de los experimentos que se realizarán.Recomendamos al menos cien mil células en total y no más de un millón y medio de células. Se desea que los agregados de V sean lo suficientemente grandes como para ser reproducibles, pero no tan grandes que el centro muera. Pelote las células mediante centrifugación a mil RPM durante 10 minutos. A cuatro grados C, ensamble cuidadosamente el filtro de cultivo de órgano.Retire todo el sobrenadante en la etapa con una P200 por cada placa. Vortexe el pellet celular durante 10 segundos para formar una suspensión. El volumen debe ser de aproximadamente uno a dos microlitros.Presione la suspensión en un gotero finamente ajustado, manteniendo la suspensión de células en la punta del gotero. Bajo nuestro microscopio estereoscópico, coloque cuidadosamente mediante aspiración con la boca la suspensión celular en el centro de un filtro de 0,8 micrómetros. Idealmente, las células deben depositarse en forma de una gota vertical, formando un círculo de uno a dos milímetros de diámetro.Si la suspensión comienza a extenderse, permita que el líquido de la suspensión drene a través del pos antes de depositar las células restantes. Coloque el recipiente en una caja de plástico tipo sándwich y séllela. Al igual que con los cultivos de órganos de timo, coloque una caja en una incubadora; nuestros cultivos agregados forman estructuras íntegras dentro de las 18 horas de cultivo.Después de cuatro a cinco días de cultivo, generarán subpoblaciones maduras tanto CD cuatro positivo ocho negativo como CD cuatro negativo ocho positivo. Comenzar con 50 lóbulos tratados con dioxazina debería proporcionar suficientes células estromales para preparar de tres a cinco cultivos reagregados. Estos cultivos suelen presentarse como montículos coherentes de células que pueden separarse de los filtros usando pinzas sin alterarlos.Acabamos de describir el método para estudiar la selección positiva mediante células epiteliales F. Este método también puede utilizarse para estudiar la selección negativa mediada por células dendríticas. Finalmente, mediante el uso de FIBROCIOS transgénicos para TCR o células estromales deficientes en MHC Clase I o deficientes en MHC Clase II.Este sistema permite investigaciones independientes sobre la selección de linfocitos T positivos para CD cuatro o positivos para CD ocho. Gracias por sintonizarnos.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra la disección y remoción del timo fetal y la preparación de cultivos ex vivo de 2-dGuo tratados con el timo.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

Sistema de cultivo tímico tridimensional para generar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Este artículo describe la metodología in vivo e in vitro para caracterizar los progenitores de sedimentación tímica mediante el análisis de la cinética de generación, fenotipo y número de su progenie de células T.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Este video muestra un protocolo para enriquecer células epiteliales tímicas (TEC) con gradiente de densidad para el aislamiento de FACS. También muestra el uso de péptidos EAK16-II/EAKIIH6 para promover la formación de agregados TEC. Los microambientes del hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 proporcionan la configuración 3D necesaria para mantener la supervivencia y la función de los TEC.

Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Este protocolo describe el aislamiento de timocitos doble negativos del timo de ratón seguido de transducción retroviral y cocultivo en el sistema de cocultivo de líneas celulares del estroma del estroma de médula ósea que expresa 4 en forma delta (OP9-DL4) para un análisis funcional adicional.

Cocultivo y transducción de timocitos murinos en células estromales que expresan 4 similares a Delta para estudiar oncogenes en leucemia de células T

Aquí, describimos un protocolo para la formación de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados en hidrogeles de fibrina 3D con el objetivo de apoyar la maduración y el mantenimiento prolongado de las células epiteliales tímicas (TEC), así como la timopoiesis in vitro.

Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Aprende a preparar cultivos de timo reagregado tratados con 2-dGuo para estudiar la diferenciación de células T y las interacciones celulares en inmunología.

Reaggregate Culturas del timo

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