Reaggregate Culturas del timo

Hola, soy Andrea White y pertenezco al laboratorio de Graham Anderson y Eric Jenkinson en el Centro MRC para la Regulación Inmune de la Universidad de Birmingham. Hoy presento un protocolo para obtener cultivos organoides tímicos reagregados, que pueden utilizarse para estudiar las complejas interacciones celulares que ocurren durante la diferenciación de linfocitos T. Antes de comenzar este procedimiento, se aislaron lóbulos tímicos embrionarios y se trataron para eliminar todos los linfocitos.

Esto puede observarse en un video aparte. Luego, los lóbulos alienoides se desagregan para producir una preparación de células estromales. Y finalmente, las células se agregan para formar una cultura organotípica de órganos fmic reagregados.

Comencemos. Después de cinco a siete días en cultivo, el LO debería estar listo para ser disgregado para preparaciones de células en cardúmenes; sumerja los filtros de 0,8 micrómetros en una placa de Petri que contenga RPMI 1640 más 10 % de FCS. Con pinzas, empuje suavemente cualquier pendiente de fibra que no flote. Utilice una pipeta de 1 mL para transferir los lóbulos a un tubo eppendorf de 1,5 mL.

Recomendamos no más de 50 lóbulos por tubo eppendorf. Deje que los lóbulos sedimenten en el fondo del tubo por gravedad unitaria y retire el medio. Lave los lóbulos con un mililitro de PBS y luego deje que los lóbulos vuelvan a sedimentar en el fondo.

Repita esto para un total de tres lavados con PBS, retire el último lavado con PBS y agregue 600 microlitros de una solución al 0,25 % de tripsina. Coloque el tubo eppendorf en un incubador a 37 grados durante 25 minutos. Triture suavemente los lóbulos utilizando una punta azul de 1 ml en una pipeta automática durante 10 segundos, y luego devuélvalo al incubador; después de 20 minutos, aspire y expulse los lóbulos varias veces para desagregarlos completamente.

Debe tomar aproximadamente 30 segundos. Para obtener una suspensión de células individuales, agregue 400 microlitros de RPMI 1640 frío con hielo más 10 % FCS para neutralizar la tripsina, precipite las células por centrifugación a mil RPM durante 10 minutos a cuatro grados C, elimine el sobrenadante y re suspenda el precipitado en un mililitro de RPMI 1640 más 10 % FCS si se desea. Cuente las células.

Típicamente esperaríamos alrededor de 50.000 células por lóbulo de dioxazina, partiendo de un tejido fibroso E15. Ahora estamos listos para formar los cultivos agregados de fmic Corgan en un tubo orph de una milla y media. Células estromales finas mezcladas, recién preparadas.

Junto con fibrocitos CD4+ CD8+ preseleccionados. Recomendamos una proporción aproximada de uno a uno entre células estromales y fibrocitos. La cantidad de células que utilizará dependerá del número de células disponibles y de los experimentos que se realizarán.

Recomendamos al menos cien mil células en total y no más de un millón y medio de células. Se desea que los agregados de V sean lo suficientemente grandes como para ser reproducibles, pero no tan grandes que el centro muera. Pelote las células mediante centrifugación a mil RPM durante 10 minutos. A cuatro grados C, ensamble cuidadosamente el filtro de cultivo de órgano.

Retire todo el sobrenadante en la etapa con una P200 por cada placa. Vortexe el pellet celular durante 10 segundos para formar una suspensión. El volumen debe ser de aproximadamente uno a dos microlitros.

Presione la suspensión en un gotero finamente ajustado, manteniendo la suspensión de células en la punta del gotero. Bajo nuestro microscopio estereoscópico, coloque cuidadosamente mediante aspiración con la boca la suspensión celular en el centro de un filtro de 0,8 micrómetros. Idealmente, las células deben depositarse en forma de una gota vertical, formando un círculo de uno a dos milímetros de diámetro.

Si la suspensión comienza a extenderse, permita que el líquido de la suspensión drene a través del pos antes de depositar las células restantes. Coloque el recipiente en una caja de plástico tipo sándwich y séllela. Al igual que con los cultivos de órganos de timo, coloque una caja en una incubadora; nuestros cultivos agregados forman estructuras íntegras dentro de las 18 horas de cultivo.

Después de cuatro a cinco días de cultivo, generarán subpoblaciones maduras tanto CD cuatro positivo ocho negativo como CD cuatro negativo ocho positivo. Comenzar con 50 lóbulos tratados con dioxazina debería proporcionar suficientes células estromales para preparar de tres a cinco cultivos reagregados. Estos cultivos suelen presentarse como montículos coherentes de células que pueden separarse de los filtros usando pinzas sin alterarlos.

Acabamos de describir el método para estudiar la selección positiva mediante células epiteliales F. Este método también puede utilizarse para estudiar la selección negativa mediada por células dendríticas. Finalmente, mediante el uso de FIBROCIOS transgénicos para TCR o células estromales deficientes en MHC Clase I o deficientes en MHC Clase II.

Este sistema permite investigaciones independientes sobre la selección de linfocitos T positivos para CD cuatro o positivos para CD ocho. Gracias por sintonizarnos.