Name: Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a preparar cultivos de órganos timo fetales tratados con 2-dGuo para estudiar el desarrollo de células T. Esta técnica permite analizar interacciones estromales y dinámicas de células linfoides in vitro.

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Los autores no tienen nada que revelar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
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In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

preparación de 2-dguo cultivos tratados con órganos timo

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

En el timo CD4, inmaduros 8 + timocitos que expresan al azar reorganizado receptor de células T-α y la cadena de b-genes someterse a eventos de selección positiva y negativa sobre la base de su capacidad para reconocer complejos self-peptide/major de histocompatibilidad (MHC) expresadas por timo las células del estroma. En el análisis in vivo del papel de las células del estroma del timo durante la selección intratímica se hace difícil por la complejidad del microambiente celular del timo en el timo de adultos en estado estacionario, y por la falta de estrategias adecuadas de marketing para manipular la expresión génica, en particular, los compartimentos estromal tímica. Hemos demostrado que el microambiente del timo puede ser fácilmente manipulado in vitro mediante el uso de reaggregate culturas timo de órganos, que permiten la preparación de las tres dimensiones de los lóbulos del timo definido las células del estroma y linfoide. Aunque otros sistemas in vitro apoyar algunos aspectos de las células T de desarrollo, el cultivo de órganos reaggregate timo sigue siendo el único sistema in vitro capaces de soportar MHC de clase I y II eficiente mediada por eventos de selección de timocitos, y por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta eficaz para estudiar la regulación celular y molecular de la selección positiva y negativa en el timo.

Este video muestra la disección y remoción del timo fetal y la preparación de cultivos ex vivo de 2-dGuo tratados con el timo.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

En el timo, se sabe que las interacciones entre los precursores de las células T en desarrollo y las células estromales, que incluyen células epiteliales corticales y medulares, desempeñan...

Hola, soy Will Jenkinson del grupo de Graham Anderson y Eric Jenkinson en el Centro MRC para la Regulación Inmunitaria de la Universidad de Birmingham. Hoy les mostraré una técnica para establecer cultivos orgánicos tímicos fetales. Además, también les mostraré cómo tratar estos cultivos orgánicos con dos dioxazinas.Y esta es una sustancia que es selectivamente tóxica para las células linfoides en el cultivo de órganos. Esta técnica tiene varias aplicaciones en el laboratorio. Una de estas aplicaciones es la producción de cultivos organoides reagregados.Otras aplicaciones incluyen el estudio de las diferentes etapas del desarrollo de los cítidos y, mediante el uso de cultivos orgánicos tímicos fetales, podemos agregar reactivos que inhiben o estimulan diferentes vías, lo que significa que podemos estudiar el papel de moléculas específicas en este proceso. Comencemos. El primer paso para preparar cultivos orgánicos del timo consiste en obtener embriones de ratón de día 14 o 15 de una o dos hembras preñadas.Primero, rocíe al ratón sacrificado con etanol al 70%. Luego, use pinzas para sujetar el pelaje y haga una incisión en forma de V en la región abdominal con tijeras, comenzando desde la vejiga y continuando hacia arriba por los dos cuernos laterales del útero. Retire el cuerno uterino y colóquelo en una placa de Petri estéril de 10 centímetros.Corte a lo largo de la longitud de la pared uterina y retire los embriones aún dentro de sus bolsas amnióticas. Lávelos en una placa de Petri que contenga 10 ml de PBS utilizando dos pares de pinzas finas. Abra cuidadosamente la bolsa amniótica y libere al embrión de la bolsa y de la placenta.A continuación, transfiera los embriones a una placa de Petri nueva que contenga 10 mL con una mezcla 50-50 de PBS y RPMI 1640. En medio con 10 %FCS, bajo un microscopio estereoscópico y con el embrión sumergido en el medio, decapite el embrión utilizando pinzas. Abra la superficie anterior de la pared torácica introduciendo las puntas de un par de pinzas cerradas en la cavidad torácica y luego abra las pinzas para exponer la cavidad torácica interna.Retire todo el árbol torácico, el corazón, los pulmones, la tráquea y el timo agarrando suavemente debajo del corazón y colóquelo en una placa de 35 milímetros que contenga cinco mililitros de RPMI 1640 más 10 %FCS en un embrión de día 14 a 15. Los lóbulos timicos rudimentarios se localizan justo por encima del corazón a ambos lados del tronco aquí.Retire lóbulos individuales del timo utilizando pinzas finas y también elimine el tejido conectivo excesivo y cualquier sangre adherida antes de expandirlos en cultivo de órganos. Ahora estamos listos para el cultivo de órganos. Para preparar un desintoxicante linfático, tome una solución madre de nueve milimoles de dióxazina y prepare 600 microlitros en una placa de Petri bacteriana de plástico de 90 milímetros.Añada cuatro mililitros de medio DMEM precalentado e incline el recipiente para que toda la superficie quede cubierta con el medio. Obviamente, si desea obtener cultivos linfoides para estudiar el desarrollo de linfocitos T, retire las dos dioxazinas usando pinzas. Coloque dos envoltorios estériles de arte, esponjas precortadas de un centímetro cuadrado, en el recipiente.Deje que el medio penetre en la esponja durante aproximadamente 30 segundos. Luego, gire la esponja para humedecer ambos lados. Esto asegura que el medio en la placa tenga acceso al tejido, nuevamente utilizando pinzas.Coloque un filtro previamente esterilizado de 0,8 micrones sobre la superficie de cada esponja. Los filtros se colocan con el lado brillante hacia arriba sobre los soportes de esponja para transferir los lóbulos tímicos al filtro de cultivo de órganos; preferimos usar una pipeta de vidrio de control matemático para fabricar pipetas de vidrio. Caliente el tubo de vidrio sobre una llama de mechero Bunsen y, cuando el vidrio esté maleable, retire el vidrio de la llama y tire de ambos extremos para estirarlo hasta no más de 10 centímetros, permitiendo que el vidrio se enfríe.Luego tire de cada extremo para romper el vidrio. Esto produce dos pipetas de vidrio cónicas. La zona delgada de cada una tiene aproximadamente cinco centímetros de longitud con una punta de unos 0,5 milímetros de diámetro.Para configurar el aparato de pipeta, coloque una punta de pipeta de plástico en el otro extremo como boquilla y coloque el extremo romo de una pipeta de vidrio dentro del tubo. Tome cuidadosamente lóbulos tímicos individuales con la pipeta bucal y colóquelos sobre la superficie del filtro de 0,8 micrones. En cultivo de órganos, recomendamos colocar de cinco a seis lóbulos tímicos en cada filtro, para un total de 10 a 12 lóbulos tímicos por placa.Esto permite suficiente espacio para que los cultivos de órganos crezcan y permite que la dioxazina elimine todas las células linfoides endógenas. Una vez que los cultivos estén preparados, arme una tapa de caja tipo sándwich con la tapa de una placa de Petri de 10 centímetros como plataforma y agua doblemente destilada justo por debajo del nivel de la plataforma. Coloque hasta tres placas dentro de la caja y selle la tapa a la caja con cinta adhesiva.La tapa debe tener dos orificios de aire de cinco milímetros perforados en esquinas opuestas. Coloque las cajas en un incubador a 37 grados Celsius con 10% CO2 durante cinco a siete días, tras lo cual desagregamos y luego reagregamos estos cultivos para estudiar las interacciones de los sitios tímicos estromales en un entorno tridimensional controlado. Después de un período de cultivo, generalmente de cinco a siete días, los f-tallos se recolectan sumergiendo los filtros en medio y empujando suavemente los lóbulos con pinzas; puede observarse que los f-tallos linfoides suelen ser más pequeños y quísticos en comparación con los lóbulos linfoides no tratados con dioxazina.Así que acabo de mostrarle la técnica para establecer cultivos orgánicos tímicos fetales. En este protocolo, le hemos mostrado cómo tratar los cultivos orgánicos tímicos fetales con dos dioxazinas, lo que agota todas las células linfoides generalmente tras cinco a siete días de cultivo del timo. Utilizamos estos cultivos orgánicos para producir cultivos orgánicos reagregados.Sin embargo, esta no es la única técnica. También utilizamos cultivos orgánicos tímicos fetales no tratados con dioxazina para transferirlos bajo la cápsula renal de un ratón tímico. Además, empleamos cultivos orgánicos tímicos fetales linfoides para estudiar el desarrollo de linfocitos T en condiciones controladas in vitro, libres de cualquier efecto secundario que pueda ocurrir in vivo.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

Reaggregate Culturas del timo

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Este video muestra un protocolo para generar linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de linfocitos T inmaduros derivados de iPSC utilizando un sistema de cultivo tímico tridimensional. El cocultivo de las células T inmaduras derivadas de iPSC con lóbulos tímicos fetales de ratones con depleción de linfocitos endógenos dio lugar a una maduración exitosa de las células T para formar emigrantes tímicos (iTE) derivados de iPSC CD8αβ+ MHC clase I+.

Sistema de cultivo tímico tridimensional para generar emigrantes tímicos derivados de iPSC

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

El estudio de las células epiteliales tímicas medulares in vitro ha sido en gran medida infructuoso, ya que los sistemas de cultivo 2D actuales no imitan el escenario in vivo. El sistema de cultivo 3D descrito en este documento, un modelo de cultivo organotípico de piel modificada, ha demostrado ser superior en la recapitulación de la proliferación de mTEC, la diferenciación y el mantenimiento de la expresión génica promiscua.

3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2'-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.

Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

Aquí, describimos un protocolo para la formación de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados en hidrogeles de fibrina 3D con el objetivo de apoyar la maduración y el mantenimiento prolongado de las células epiteliales tímicas (TEC), así como la timopoiesis in vitro.

Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Aprende a preparar cultivos de órganos timo fetales tratados con 2-dGuo para estudiar el desarrollo de células T. Esta técnica permite analizar interacciones estromales y dinámicas de células linfoides in vitro.

Preparación de 2-dGuo cultivos tratados con órganos timo

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