Name: Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende a preparar y mantener cultivos compartimentados de neuronas de ganglios de raíz dorsal usando embriones de rata E15. Este método permite estudiar el crecimiento axonal y la señalización de neurotrofinas en neurociencia.

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Nos gustaría dar las gracias a Katharina Cosker Courchesne y Stephanie útil para los debates.

Preparación de los reactivos <ol><li> Revestimiento de colágeno: el colágeno capa p35 placas de cultivo de tejidos y colocar en un horno a 37 ° C durante 2 días antes de engrasar los divisores. La concentración final de colágeno debe estar en 0,71 mg / ml diluida en 0,001 N HCl. A continuación, añadir 1 ml de la mezcla por placa. </li><li> Cargadores de grasa: A fin de llenar el cargador de grasa, una jeringa de 60 ml debe ser llenado con grasa de vacío Corning. Use la jeringa para llenar el cargador de grasa, lo envuelve en papel de aluminio y luego autoclave durante 45 minutos. </li><li> Separadores de teflón: los separadores se pueden volver a utilizarse después de cada experimento, pero primero debe limpiarse de forma correcta. Retire el separador de la placa, limpie toda la grasa restante y el lugar en ácido sulfúrico durante 2 días. Después de la eliminación del ácido, enjuagar con agua 3 veces, hacer hervir durante 20 minutos, deje que se seque, coloque en un recipiente de vidrio p100 Petri y autoclave durante 20 minutos. </li><li> N2-metil: Pesar 1,5 g de metilcelulosa y colocarlo en un frasco de 500 ml. Añadir una barra de agitación y autoclave durante 20 minutos en seco (a partir de este momento todo el trabajo debe ser estéril). A continuación, añadir 500 ml de suero libre de los medios de comunicación (N 2), y revuelva en una cámara frigorífica hasta que se disuelva. Alícuota en 50 ml conicals y congelar a -20 ° C. Para las acciones de trabajo, alícuota de una de las 50 conicals mL en tubos de 1 ml y congelar a -20 ° C. </li><li> DRG los medios de comunicación: DMEM, 5% de suero de caballo inactivado por calor, y el 1% de penicilina estreptomicina. </li><li> 100ng/mL DRGN los medios de comunicación: La concentración de acciones de ambas factor de crecimiento nervioso (NGF) y el cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) es 1mg/ml. Diluir cada una de las neurotrofinas 1:10.000 en los medios de comunicación DRG. Las culturas pueden ser cultivadas en NGF solo, lo que altera el complemento de las neuronas que sobreviven en los cultivos. Nota: Cuando sea necesario, la concentración de (arabinósido de citosina) es AraC 1um y se utiliza a una concentración final de 0.3uM. Esto inhibe el crecimiento de las células de Schwann y la glía otros. </li><li> 10ng/ml DRGN los medios de comunicación: Diluir el 100ng/mL DRGN los medios de comunicación (1:10) con los medios de comunicación DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="392" height="294"> Figura 1. Herramientas necesarias para la puesta en marcha </li></ol> Configuración de las cámaras de compartimentos (iniciar este proceso de 1-2 días antes de la disección) <ol><li> Hacer un rasguño en el medio de un colágeno recubiertas p35 plato con un movimiento hacia afuera. </li><li> 30ul lugar de N2-metil-celulosa en el medio de la nada. Set platos a un lado hasta divisor es engrasada. </li><li> Conecte un adaptador de calibre 23 stub luer al cargador de grasa. Sujete el separador de teflón con un par de pinzas hemostáticas 90 º de ángulo y déjelo con el divisor hacia arriba con un microscopio. Trazar la divisoria con la grasa de asegurarse de que cada vez que el adaptador se coloca en un nuevo punto de partida se inserta el adaptador en la grasa del paso anterior para que haya una línea continua de grasa (ver diagrama). Una vez que la grasa se aplica a la división entera, a su vez uno de los platos preparados p35 boca abajo y colocarlo de modo que el N2-metil-celulosa es el compartimiento medio. Presione sobre el fondo del plato con un par de pinzas. Asegúrese de presionar en el interior de la división en las cuatro esquinas (arriba a la izquierda, abajo a la derecha, parte superior derecha, inferior izquierda, se indica en el diagrama de "X"). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figura 2" width="171" height="183"> Figura 2: Pasos para engrasar el divisor Nota: Es importante que se mantenga la firmeza necesaria para que la grasa hace que el sellado completo con el plato, pero si la presión se agrega demasiado, los axones no se cruzarán en los compartimientos laterales. Levante el hemostatos, dale la vuelta y despinzar el divisor. Por último, coloque el plato con el divisor firmemente bajo el microscopio se centra en la parte inferior del compartimento del medio. Con el cargador de la grasa, hacer una pequeña barrera (0,25 cm), de modo que una vez que las células se colocan en el compartimiento medio que no pueda escapar. </li><li> Después de haber creado varias culturas, los medios de comunicación en lugar DRG cada uno de los compartimentos laterales y colocar en una incubadora en la que las células se mantendrá. Permita que las culturas a sentarse por varias horas y luego compruebe si hay fugas. Si los medios de comunicación se ha filtrado en el compartimiento del medio, entonces la cultura no se puede utilizar. Nota: La primera vez que el aprendizaje de esta técnica, es importante crear más cultivos que se necesitan para un experimento, ya que varios se gotean. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figura 3" width="254" height="191"> Figura 3: "Good vs fugas" cultura </li></ol> El mantenimiento de las neuronas DRG en las culturas en compartimentos <ol><li> Día 1: Reemplazar DRG los medios de comunicación en los compartimientos del lado de los medios de comunicación 100ng/mL DRGN + AraC. Realizar la disección y añadir las células en el compartimiento central (100.000 células). </li><li> Día 2: Agregar 10ng/ml los medios de comunicación + AraC en el exterior de la división de teflón hasta que los medios de comunicación fluye sobre la barrera de grasa y fluido intercambio con el compartimiento central. </li><li> Día 3: Vuelva a colocar los medios de comunicación en los compartimientos de un lado a 100ng/mL DRGN omitiendo el AraC y alrededor de las con 10ng/ml DRGN omitiendo el AraC. </li><li> Día 6: Vuelva a colocar los medios de comunicación en los compartimientos de un lado a 1ng/ml + AraC y rodearse de los medios de comunicación DRG + AraC. </li><li> Día 9: El uso de la experimentación. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figura 4" width="267" height="148"> Figura 4: las imágenes IHC de los cuerpos celulares y axones distales Nota: Al cambiar los medios de comunicación, es importante para aspirar el líquido de la parte superior del compartimento de cada lado. Además, nunca cambiar los medios de comunicación desde el compartimento del medio en sí, sólo desde la rodean, y dejar que fluya sobre la barrera de grasa en el centro. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

En este video, nos han demostrado cómo preparar y mantener cámaras de compartimentos para su uso en el cultivo de neuronas DRG. Hecho correctamente, este sistema permite la separación del cuerpo celular del axón con el fin de estudiar los mecanismos por los cuales las neurotrofinas señal a través de los axones largos. Dado que no es el aislamiento de fluidos entre los compartimientos, permite la estimulación selectiva o el tratamiento de un compartimiento sin los otros compartimientos se vean afectados. Culturas compartimentados cámara pued...

<table><tbody><tr><td>colágeno</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulosa N2 400CPS</td><td>Reactivo</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>divisor de teflón</td><td>Otro</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>existen muchos otros tipos de divisores disponibles</td></tr><tr><td>rastillo de alfileres</td><td>Herramienta</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>cargador de grasa</td><td>Herramienta</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reactivo</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reactivo</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>grasa de alto vacío</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>adaptador luer de 23 gauge</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>hemostatos en ángulo de 90&amp;#x00B0;</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Las neuronas se extienden axones que están muy lejos del cuerpo celular para inervar los tejidos diana, donde objetivo de factores de crecimiento derivados son necesarios para la supervivencia neuronal y la función. Las neurotrofinas son especialmente necesarias para mantener la supervivencia y la diferenciación de las neuronas sensoriales que inervan pero la pregunta de cómo estas neurotrofinas derivadas de objetivos comunicar al cuerpo celular de las neuronas que inervan ha sido un área de investigación activa por más de 30 años. El modelo más comúnmente aceptada de cómo las señales de neurotrofinas llegar al cuerpo de la célula se propone que la señalización endosomas llevar a esta señal de forma retrógrada a lo largo del axón. A fin de estudiar el transporte retrógrado, un sistema de cultivo fue concebido originalmente por Robert Campenot, en el que los cuerpos celulares están aislados de sus axones. La técnica de preparación de estas cámaras de compartimentos para el cultivo de neuronas sensoriales recapitula la estimulación selectiva de terminales de las neuronas que se produce la liberación in vivo de los siguientes derivados de objetivos neurotrofinas. Retrógrada eventos de señalización que requieren transporte a larga distancia microtúbulos retrógrada dependientes tienen importantes implicaciones para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

A continuación se describe la técnica de preparación y mantenimiento de cámaras de compartimentos de las neuronas sensoriales de cultivo de los ganglios de la raíz dorsal.

Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos

Las neuronas extienden prolongaciones axonales que se alejan considerablemente del cuerpo celular para inervar los tejidos diana, donde se requieren factores de crecimiento derivados del tejido diana para...

Este procedimiento comienza haciendo un arañazo con un rastrillo de alfileres en el centro de una placa recubierta con colágeno y pipeteando 30 microlitros de metilcelulosa en el centro de los arañazos. Lubrique cada separador utilizando un cargador de grasa y fíjelo a una placa recubierta con colágeno. Coloque 100.000 células de embriones de rata E15 en el compartimento central.Después de nueve días, las células habrán extendido axones hacia el compartimento lateral y estarán listas para los experimentos. Hola, soy Maria Murphy del laboratorio de la Dra. Rosalyn Siegel en el Departamento de Oncología Pediátrica del Instituto de Cáncer Dana-Farber. Hoy les mostraremos un procedimiento para la preparación y el mantenimiento de neuronas de ganglios de la raíz dorsal en cultivos compartimentados.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la señalización de neurotrofinas. Así que comencemos. Antes de preparar las cámaras compartimentadas, las placas de cultivo de tejidos P 35 deben recubrirse con colágeno.Para hacer esto, agregue un mililitro de una solución de colágeno al 0,71 miligramo por mililitro en HCl 0,001 N a las placas e incube a 37 grados Celsius dura

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

Este video muestra un procedimiento para aislar neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de embriones de rata y co-cultivarlas con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann maduras. Los DRG aislados se procesan para aislar las neuronas y las células gliales. Las células aisladas se cultivan para purificar las neuronas, que luego se cultivan conjuntamente con células similares a las células de Schwann (SCLC) en un medio de cocultivo. La interacción con las neuronas...

Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

Este video muestra la construcción de un sistema de cultivo celular de tres compartimentos utilizando colágeno y grasa no reactiva. Este sistema se utiliza para observar las interacciones entre las células de glioma y los axones en tiempo real.

Preparación de placas de cultivo compartimentadas recubiertas de colágeno para el cultivo de células neuronales

El video demuestra el co-cultivo de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) con células de Schwann. Las neuronas DRG crecen primero en una membrana preestirada para el crecimiento de axones alineados. A continuación, se introducen las células de Schwann, que se adhieren a los axones, aislándolos y promoviendo la supervivencia y la función de las células neuronales.

Cocultivo de células de Schwann con neuronas DRG en una membrana preestirada

Este video muestra un método para recolectar neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). La DRG de la columna vertebral de una rata se aísla, se trata con enzimas y luego se disocia mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las neuronas se separan de las células gliales mediante centrifugación en gradiente de densidad y se cultivan en un medio de crecimiento.

Una técnica para recolectar y disociar ganglios de la raíz dorsal para cultivos neuronales

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de la columna vertebral de rata. Los GRD extirpados de la columna vertebral se tratan con enzimas y se disocian mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las células se cultivan en un medio que contiene inhibidores y factores de crecimiento que limitan la proliferación de células gliales y promueven el crecimiento neuronal, respectivamente.

Establecimiento de un cultivo primario de células de ganglios de raíz dorsal a partir de una columna vertebral de rata

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Cultivos primarios de raíz dorsal (GRD) de los ganglios se utilizan con frecuencia para estudiar las funciones fisiológicas o eventos relacionados con patología en las neuronas sensoriales. Aquí, se demuestra el uso de culturas DRG lumbares para detectar la liberación de neurotransmisores después de receptor del neuropéptido FF tipo 2 estimulación con un agonista selectivo.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

Aprende a preparar y mantener cultivos compartimentados de neuronas de ganglios de raíz dorsal usando embriones de rata E15. Este método permite estudiar el crecimiento axonal y la señalización de neurotrofinas en neurociencia.

Preparación y mantenimiento de las neuronas dorsales ganglios de raíz en las culturas con compartimientos

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