Name: El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprende a generar un modelo de encefalopatía isquémica hipóxica en ratas neonatas mediante ligadura de la arteria carótida común izquierda e hipoxia controlada. Este método permite estudiar lesiones cerebrales perinatales.

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Financiado por la American Heart Association y March of Dimes.

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad de Stanford y se rige por los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de experimentación. Rata neonatal modelo HIE <ol><li> Días después del parto (PND) 7 Sprague-Dawley, crías de ratas (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) son completamente anestesiados con isoflurano (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL, un 3-4% para la inducción y 2.1% para de mantenimiento). </li><li> Una pequeña incisión en el cuello (Extra Thin Tijeras Iris # 14088-10, Artes Ciencia Herramientas Inc, Foster City, CA) para exponer la arteria carótida común izquierda (CCA). </li><li> La CCA se liga con una sutura de seda 5-0 (5-0 seda, Ethicon, Somer, NJ). </li><li> La incisión se cierra con el pegamento de cianoacrilato (Elmers Products Inc, Columbus, OH). La incisión se cubre con cinta adhesiva y la anestesia se detiene. Los cachorros son devueltos a sus presas y les permite recuperar durante 1-2 horas. </li><li> Los cachorros se colocan en una cámara hipóxica que contiene 8% de oxígeno equilibrada con un 92% de nitrógeno durante 100 minutos a 37 ° C. 8% de nitrógeno oxygen/92% de gas (Airgas, Sacramento, CA) el flujo a través de un tubo en la jaula del ratón equipado con una cubierta de plástico. La cubierta está hecha para adaptarse a la jaula y tiene dos agujeros de 2 cm de diámetro, una de ellas para recibir el tubo conectado al tanque de oxígeno del gas de 8% y el otro permite que el gas flowout. La cámara se coloca en un baño de agua y se calienta antes de su uso y un termómetro en el interior de la misma debe registrar 37 ° C antes del comienzo de la hipoxia. </li><li> Al final de 100 minutos de hipoxia, los cachorros son devueltos de nuevo a su presa para la recuperación. </li><li> 24 horas después del final de la hipoxia, las crías son sacrificados por la anestesia profunda con isoflurano. El tejido cerebral es perfundido con solución salina normal en frío, seguido por una solución de 1% de TTC frío en tampón fosfato salino pH 7,4 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). TTC debe mantenerse protegido de la luz. </li><li> Los cerebros se retiran y se enfrían durante 1-2 minutos en hielo, y cuatro secciones coronales de 3 mm de distancia (niveles 1-4) se cortan, a partir de rostral a nivel de la opticchiasm e infundíbulo, que corresponde a la bregma 1,8 ~ 2,0 mm a nivel de el cerebro del ratón adulto. </li><li> Cortes de cerebro se encuentran inmersos en una solución de TTC y se incuba a 37 ° C durante 8 minutos, seguido de la fijación en paraformaldehído al 4% / PBS durante la noche. Debido a TTC es sensible a la luz, mantener las rebanadas de la luz durante este tiempo. </li><li> Las secciones teñidas TTC son escaneados y digitalizados. Con Image J (NIH, Bethesda, MD), los siguientes son medidos para cada nivel: área de infarto (área sin manchas), la zona del hemisferio ipsilateral, y la zona del hemisferio contralateral. El porcentaje de área infartada por rebanada se calcula como: (área de infarto / área del hemisferio ipsilateral) o A 1, A 2, A 3 y A 4. El porcentaje de volumen de infarto se calcula como la suma de (A 1 + A 2 + A 3 + A 4) * 3 mm. Las zonas de lesión cortical o estriado también puede ser cuantificado por separado de una manera similar. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/old/955_2008_9_2_2/955_Fig-01.png" alt="Figura 1" width="660" height="190" /> Figura 1. Representante HIE coronal niveles 1-4 teñidas con TTC. TTC coronal secciones teñidas demostrar área de infarto (en blanco).

<ol><li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+Hypoxic-Ischemic+Brain+Damage%3A+Evolution+of+an+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model.</a> Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).</li>
<li>Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+moderate+hypothermia+after+neonatal+hypoxia-ischemia%3A+short-+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome.</a> Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).</li>
<li>Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypothermia+and+hyperthermia+on+attentional+and+spatial+learning+deficits+following+neonatal+hypoxia-ischemic+insult+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats.</a> Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).</li>
<li>Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+post-hypoxic-ischemic+hypothermia+markedly+delays+neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+development%22%5BJournal%5D)">Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury.</a> Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).</li>
<li>Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+graded+hypothermia+on+hypoxic-ischemic+brain+damage%3A+a+neuropathologic+study+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).</li>
<li>Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+therapy+reduces+apoptosis+in+neonatal+hypoxia-ischemia+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model.</a> Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).</li>
<li>Grow, J., Barks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+hypoxic-ischemic+cerebral+injury+in+the+term+infant%3A+current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+perinatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts.</a> Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).</li>
<li>Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+brain+damage+after+hypoxic+ischemia+in+immature+adenosine+A2A+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).</li>
</ol>

El modelo de roedores postnatal HIE es un modelo establecido que la hipoxia cerebral recapitula que ocurren en el periodo perinatal en los recién nacidos. Amplia estudios de caracterización histológica y inmunocitoquímicos han demostrado que los roedores 7 días de edad tiene la madurez cerebral similar a un modelo de siete en el tercer trimestre el feto humano. El modelo de HIE roedores ha sido muy informativo para entender los mecanismos de la lesión cerebral de la hipoxia perinatal 2, donde las intervenciones, como l...

<table><tbody><tr><td>Crias de rata Sprague-Dawley</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Cirugía</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gas de 8% oxígeno / 92% nitrógeno</td><td>Cirugía</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

el modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

Encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) es la consecuencia de asfixia sistémica que ocurre desde el nacimiento. Veinticinco por ciento de los recién nacidos con EHI desarrollan secuelas neuropsicológicas graves y permanentes, como retraso mental, parálisis cerebral y epilepsia. Los resultados de HIE son devastadores y permanentes, por lo que es fundamental para identificar y desarrollar estrategias terapéuticas para reducir el daño cerebral en los recién nacidos con EHI. A tal fin, el modelo de rata neonatal para la lesión cerebral hipóxico-isquémica se ha desarrollado el modelo de esta condición humana. El modelo de HIE fue validado por primera vez por Vannucci et al 1, y desde entonces ha sido ampliamente utilizada para identificar los mecanismos de lesión cerebral como consecuencia de la hipoxia-isquemia perinatal 2 y para probar posibles intervenciones terapéuticas 3,4. El modelo de HIE es un proceso de dos etapas y consiste en la ligadura de la arteria carótida común izquierda seguido por la exposición a un ambiente hipóxico. El flujo sanguíneo cerebral (FSC) en el hemisferio ipsilateral a la arteria carótida liga no disminuye por el flujo sanguíneo colateral a través del polígono de Willis, pero con la tensión de oxígeno baja, la CBF en el hemisferio ipsilateral y disminuye significativamente los resultados en la lesión isquémica unilateral . El uso de 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro (TTC) para teñir e identificar el tejido cerebral isquémico se desarrolló originalmente para los modelos adultos de la isquemia cerebral de roedores 5, y se utiliza para evaluar el grado de infarctin cerebral a los puntos de tiempo de hasta 72 horas después del evento isquémico 6. En este video, se demuestra el modelo de lesión hipóxico-isquémica en cerebro de rata postnatal y la evaluación del tamaño del infarto mediante la tinción de TTC.

El modelo de rata postnatal para la lesión cerebral hipóxico-isquémica es un modelo bien establecido de los derechos humanos neonatal encefalopatía hipóxica isquémica (EHI). En este artículo se describe el modelo de HIE en crías de ratas post-natal.

El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

La encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI) es la consecuencia de una asfixia sistémica ocurrida durante el nacimiento. El veinticinco por ciento de los neonatos con EHI desarrollan cuadros graves de...

Para inducir este modelo de encefalopatía hipóxica-isquémica en animales posnatales, los ratones Sprague Dawley del día siete se someten a una microcirugía y ligadura de la arteria carótida común izquierda. Tras un período de recuperación de una a dos horas, las crías se colocan en una cámara hipóxica a 37 grados Celsius durante 100 minutos.A continuación, las crías se devuelven a su madre hasta que son sacrificadas. Tras dos pasos de perfusión sistémica, se extraen los cerebros y se seccionan en rodajas de tres milímetros de grosor. Luego, las rodajas se tiñen utilizando una solución de 1% de 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro, o solución de TTC, con el fin de revelar el área de infarto.Hola, soy Hi tango del Laboratorio Andre en el Departamento de Neurología y Ciencias Neurológicas de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Hoy les mostraremos un procedimiento para el modelo de lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el mecanismo de la encefalopatía hipóxico-isquémica en el cerebro neonatal, con el objetivo final de desarrollar nuevos tratamientos.Así que comencemos. Para iniciar el procedimiento, anestesie completamente una cría de rata spray dolly de siete días posnatales. Con isoflurano, utilizamos el 4 % para la inducción y del 1 al 2 % para el mantenimiento.Después de unos minutos, realice una prueba de pellizco en el dedo del pie para asegurarse de que la cría esté anestesiada. Luego, esterilice el cuello de la cría utilizando aplicadores de algodón para aplicar yodo-povidona al 10 %, seguido de alcohol isopropílico al 70 %. A continuación, use tijeras estériles de iris extrafinas de Fine Science Tools para hacer una pequeña incisión aproximadamente cinco milímetros a la izquierda de la línea media y exponer la arteria carótida común izquierda o CCA mediante disección roma.Asegúrese de eliminar el tejido conectivo y el nervio vago, que podría enredarse con la ACC. Luego, utilice un hilo de sutura de seda cinco ceros de Ethicon para ligar la ACC.El color del vaso sanguíneo por encima del sitio de ligadura debe volverse blanco inmediatamente después de la ligadura. Tras la ligadura, cierre la incisión con adhesivo de cianoacrilato y cúbrala con cinta. A continuación, detenga la anestesia y asegúrese de que la cría recupere la conciencia.Coloque la cría en una caja de recuperación sobre una almohadilla tibia. Repita el procedimiento en crías adicionales según sea necesario. Observe a las crías durante al menos cinco minutos antes de devolverlas a su madre.Deje que las crías se recuperen durante una o dos horas antes del experimento. Monte una cámara hipóxica que contenga 8% de oxígeno, equilibrada con 92% de nitrógeno. Para ello, obtenga una jaula para ratones equipada con una tapa de plástico que tenga dos orificios de dos centímetros de diámetro.Un orificio recibe el tubo conectado al tanque de gas mixto, que contiene 8% de oxígeno y 92% de nitrógeno. El otro orificio permite que el gas salga; coloque la cámara en un baño de agua y luego introduzca un termómetro en la cámara. El termómetro debe registrar 37 grados Celsius antes del inicio de la hipoxia.Una vez que las crías se hayan recuperado, colóquelas en la cámara hipóxica durante 100 minutos a 37 grados Celsius. Luego, devuelva las crías a su madre 24 horas después del final de la hipoxia y eutanásielas mediante anestesia profunda con iso fluorano. A continuación, realice una perfusión intracardiaca a través del ventrículo izquierdo utilizando suero salino normal frío, seguida de una solución fría de 1 % de TTC en P-B-S-T-T-C, que es sensible a la luz y debe mantenerse protegida de la misma.Después del paso de perfusión, coloque la cabeza sobre hielo durante uno o dos minutos y luego exponga el cerebro utilizando una cuchilla de afeitar enfriada con hielo para seccionar el tejido cerebral en cuatro niveles. Utilice una espátula para extraer los cortes cerebrales y sumerja los cortes cerebrales en la solución de TTC.Coloque las secciones en un incubador a 37 grados Celsius durante ocho minutos para permitir la tinción con TTC. A continuación, transfiera las secciones a paraformaldehído al 4 % en PBS y cúbralas. Dado que el TTC es sensible a la luz, coloque las secciones a cuatro grados Celsius y déjelas fijar durante la noche tras la fijación prolongada.Escaneé y digitalice las secciones teñidas con TTC y continúe con el análisis de los resultados. A continuación se muestran resultados representativos de encefalopatía hipóxico-isquémica, niveles coronales del uno al cuatro teñidos con TTC. Las áreas blancas sin tinción indican las áreas de infarto utilizando ImageJ. Para cada nivel, se miden lo siguiente: el área de infarto A y el área del hemisferio ipsilateral B. Con base en estas mediciones, se calcula el porcentaje de área infartada por corte como el área de infarto dividida por el área del hemisferio ipsilateral, es decir, A uno sobre B uno, A dos sobre B dos, A tres sobre B tres y A cuatro sobre B cuatro.Luego, el porcentaje de volumen de infarto se calcula como la suma de a 1, 2, 3 y cuatro, multiplicado por tres milímetros, dividido por la suma de B 1, 2, 3 y cuatro multiplicado por tres milímetros. Las áreas de lesión cortical o de la SAL también pueden cuantificarse por separado de manera similar. Acabamos de mostrarle cómo generar un modelo de encefalopatía hipóxico-isquémica de isquemia perinatal.Al realizar este procedimiento, es importante recordar limitar la anestesia a no más de 10 minutos para cada ligadura de la CCA, colocar siempre un termómetro en la cámara hipóxica y mantener la temperatura a 37 grados centígrados. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Modelos de animales grandes tienen buenos valores de traslación en el examen de fisiología y farmacología de la asfixia neonatal. Utilizando los lechones recién nacidos, desarrollamos un protocolo experimental para simular asfixia neonatal que tiene ventajas de estudiar la hemodinámica sistémica y regional, el transporte de oxígeno a las vías bioquímicas y patológicas y correlaciones.

Un modelo porcino de la asfixia neonatal

El video muestra el procedimiento para crear un modelo de ratón para estudiar la lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal. Describe los pasos para inducir quirúrgicamente la isquemia y someter al animal a hipoxia para exacerbar el daño cerebral. Por último, se muestra cómo evaluar las lesiones cerebrales resultantes, asegurando que el modelo de ratón esté preparado para futuras investigaciones científicas.

Establecimiento de un modelo murino de lesión cerebral hipóxico-isquémica neonatal

Fuente: Jantzie, L. L., et. al. Modelado de la encefalopatía del prematuro mediante hipoxia-isquemia prenatal con lipopolisacárido intraamniótico en ratas. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra un protocolo para inducir condiciones hipóxico-isquémicas e inflamatorias en ratas fetales mediante la restricción del flujo sanguíneo uterino y la inyección de LPS, modelando la neuroinflamación y el desarrollo cerebral interrumpido relevante para los estudios de nacimientos prematuros.

Inducción de condiciones hipóxico-isquémicas e inflamatorias para modelar la encefalopatía en ratas prenatales

La encefalopatía hipóxico-isquémica después de la asfixia perinatal se puede estudiar utilizando modelos animales. Demostramos los procedimientos necesarios para establecer un modelo de lechón de encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal.

Un modelo del cochinillo de Neonatología encefalopatía hipóxico-isquémica

Los modelos de ictus tromboembólicos son herramientas vitales para optimizar la terapia de recanalización. Presentamos un modelo murino de ictus trombótico basado en el insulto hipóxico-isquémico cerebral transitorio (tHI), que desencadena trombosis e infarto, y responde favorablemente a la fibrinólisis mediada por el activador tisular del plasminógeno (tPA) en una ventana terapéutica similar a la de los pacientes con ictus.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

La encefalopatía del prematuro abarca las anomalías del sistema nervioso central asociadas con las lesiones del parto prematuro. Este informe describe un modelo de rata clínicamente relevante de hipoxia-isquemia sistémica transitoria en el útero y administración de lipopolisacáridos intraamnióticos (LPS) que imita la corioamnionitis, y el impacto relacionado de los estímulos infecciosos y la subperfusión placentaria en el desarrollo del SNC.

Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

El accidente cerebrovascular neonatal es una causa significativa de lesión cerebral temprana que requiere un modelo traslacional con patrones de lesión focal consistentes y alta reproducibilidad para permitir el estudio. Este estudio describe el procedimiento quirúrgico detallado para crear una lesión focal no hemorrágica, unilateral por isquemia-reperfusión en roedores equivalentes a término.

Transitoria de la arteria cerebral media oclusión Modelo de accidente cerebrovascular neonatal en ratas P10

Se realizó oclusión unilateral de la arteria carótida en día postnatal 7-10 CD-1 ratón cachorros para crear un modelo de (HI) hipóxico-isquémica neonatal e investigó los efectos de la lesión cerebral HI. Estudiamos las funciones neuroconductuales en estos ratones, en comparación con ratones normales no funcionan.

Evaluación neuroconductual en un modelo murino de lesión de cerebro hipóxico-isquémica Neonatal

El método describe la lesión cerebral hipoxic-isquémica e hiperoxica con sensibilidad a la inflamación-sensificada e hiperoxica en el hurón P17 para modelar la interacción compleja entre la inflamación prolongada y la lesión cerebral oxidativa experimentada en una serie de bebés prematuros tardíos.

Un modelo de hurón de lesión cerebral hipoxic-isquémica tardía con sensibilidad tardía

Este manuscrito describe un método para grabaciones continuas de video EEG utilizando electrodos de profundidad múltiple en ratones neonatales sometidos a hipoxia-isquemia.

Electroencefalograma de video continuo durante la hipoxia-isquemia en ratones neonatales

Aprende a generar un modelo de encefalopatía isquémica hipóxica en ratas neonatas mediante ligadura de la arteria carótida común izquierda e hipoxia controlada. Este método permite estudiar lesiones cerebrales perinatales.

El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

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