Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo
2 de febrero de 2009
Este video muestra todo inmunohistoquímica montaje, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de un antígeno puede ser visualizado en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell.
Este video demuestra los diferentes pasos de la inmunohistoquímica en montaje completo en embrión de pollo utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Primero, el embrión se fija en paraformaldehído. Luego, la actividad de peroxidasa endógena se inhibe.
A continuación, el embrión se incuba en anticuerpo primario. Después de varios lavados, el embrión se incuba en anticuerpo secundario conjugado con HRP; la reacción de color se revela utilizando sustrato DAB y la tinción con anticuerpos aparece de color naranja. La ventaja de este método frente al uso de anticuerpos fluorescentes es que los embriones pueden procesarse para su inclusión en parafina, lo que permite el estudio de los sitios antigénicos en secciones transversales.
Hola, soy Delphine del Laboratorio de FIN en el Centro de Medicina Genómica y Ambiental de Texas A&M en Houston. Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar inmunomarcaciones con anticuerpos, tinciones en embriones de pez cebra utilizando anticuerpos conjugados con HRP. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la morfología de los embriones tras el tratamiento con fármacos antiepilépticos.
Así que comencemos a realizar la inmunohistoquímica en montaje completo en embriones de pollo. Primero, abra un huevo golpeando el cascarón con pinzas y retirando trozos del mismo. Retire el albúmino espeso con pinzas e incline la vesícula vitelina con pinzas gruesas para que el embrión quede orientado hacia arriba.
A continuación, use tijeras finas para cortar un cuadrado de la bolsa de vitelo alrededor del embrión. Retire el embrión del vitelo con una cuchara y colóquelo en un recipiente que contenga PBS bajo un microscopio de disección. Retire cuidadosamente las membranas del vitelo y transfiera el embrión a un recipiente nuevo que contenga PBS.
Después de transferir el embrión, sujételo con pinzas y alfileres para insectos, y aspire el PBS. Reemplace esto con PFA al 4 % en PBS y deje que el embrión se fije durante una hora a temperatura ambiente para minimizar la posible contaminación microbiana. Use agua desionizada D H2O cuando realice todos los pasos siguientes tras la fijación del embrión, aspire la solución fijadora y deseche adecuadamente como residuo químico.
Llene el recipiente con BS. A continuación, utilizando un cuchillo de microdisección, corte un cuadrado alrededor del embrión para eliminar las membranas extraembrionarias. Retire los alfileres de insecto con pinzas después de que los alfileres hayan sido eliminados. Utilice una pipeta Pasteur de extremo romo para transferir el embrión a un vial de centelleo que contenga PBT.
Lave el embrión con PBT tres veces durante 10 minutos cada una. Retire el PBT del vial de centelleo y sustitúyalo por PBTX que contenga H2O2 al 0,3 % para inactivar la peroxidasa endógena potencial. Incube durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador.
Lave el embrión con PBT primero tres veces durante 10 minutos cada vez, luego tres veces durante 30 minutos cada vez. Para teñir el embrión con anticuerpo, comience por lavar el embrión durante una hora en tampón bloqueante o en BSA al 1% y NGS al 1%.
Utilizamos NGS porque el anticuerpo secundario se produjo en cabra. Incube en mutator durante una hora a temperatura ambiente; después de la incubación, diluya el anticuerpo primario uno a uno en tampón de bloqueo e incube el embrión en esta solución durante dos días a cuatro grados Celsius. En mutator.
El factor de dilución del anticuerpo primario depende de la elección del anticuerpo primario. Aquí utilizamos un anticuerpo del banco híbrido de estudios de desarrollo DOMA, que se proporciona como super natin. Lo diluimos uno a uno en tampón de bloqueo.
A continuación, realice tres lavados de 10 minutos en PBT seguidos de tres lavados de una hora en PBT. Después del lavado, diluya el anticuerpo secundario uno a 2.500 en tampón bloqueante. En este caso, anticuerpo secundario de cabra anti-US IgG conjugado con peroxidasa, e incube el embrión en esta solución durante la noche a cuatro grados Celsius en agitación.
Realice tres lavados de 10 minutos en PBT seguidos de tres lavados de una hora en PBT para desarrollar la reacción de color del embrión teñido. Realice primero dos lavados de 20 minutos en tampón tris (tris 100 milimolar, HCl pH 7,4). A continuación, retire el último lavado de tampón TS del vial que contiene el embrión y reemplácelo con cinco mililitros de solución DAB.
Manténgalo en la oscuridad sobre el mutador durante 20 minutos. Deseche la punta de einor en el recipiente que contiene una solución de lejía al 10%. Para descontaminar el DAB, agregue 16 microlitros.
Añada la solución madre de H₂O₂ al vial que contiene los embriones en DAB. Mantenga en la oscuridad. Después de 10 minutos, supervise la reacción al microscopio hasta que la reacción de color esté completa. Deseche el DAB en el recipiente con lejía y reemplace con cinco mililitros.
Agua del grifo. A continuación, realice dos lavados de 10 minutos en PBS para su procesamiento destinado a fotografía y microtomía en parafina. Deshidrate el embrión teñido mediante una serie de etanol al 25%, 50%, 75% y 100%, durante 10 minutos cada uno.
Después de la deshidratación, sustituya el etanol por 0,5 a un mililitro de aceite de madera de cedro. Esto hará que el embrión se vuelva transparente para la fotografía en aceite de madera de cedro. Tras la fotografía, devuelva el embrión al vial y sustituya el aceite de madera de cedro por etanol al 100 %.
Finalmente, sustituya el etanol por verde rápido FCF al 5% en etanol al 100% e incube durante tres minutos. Este paso hará que los embriones sean visibles para la histología. Sustituya la solución de verde rápido FCF por etanol al 100% y proceda con la histología.
A continuación se muestran tres ejemplos de embriones teñidos. Estos embriones de la fase 11 están marcados con 15.3 B nueve o no. Uno es un anticuerpo específico del cordón nodal desarrollado en el laboratorio de Jane Dod y Tom Gessel.
Después de dos minutos en DAB, el embrión sigue siendo transparente. Después de 20 minutos en DAB, aparece una leve marcación en el cordón nodal. Finalmente, tras 40 minutos, la marcación del cordón nodal está completa.
En este ejemplo, mostramos cómo el PAC siete, un anticuerpo desarrollado en el laboratorio de Tom Jessel, reconoce las etapas tempranas del cierre del tubo neural, así como las células de la cresta neural craneal que emergen del mesencéfalo. Aquí, el embrión está marcado con la sonda Croc 20 del laboratorio de David Wilkinson, seguido de no uno, sino un anticuerpo. Acabamos de mostrarle cómo realizar inmunohistoquímica en montaje completo en embriones.
Este procedimiento también puede utilizarse en embriones que previamente han sido procesados para hibridación in situ en montaje completo. En este caso, fije brevemente el embrión durante una hora tras la hibridación in situ y luego continúe con la tinción con anticuerpos. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este video demuestra la inmunohistoquímica en preparación completa, una técnica utilizada para visualizar los patrones espaciales y temporales de expresión de antígenos en embriones jóvenes de pollo. El método comprende varios pasos, incluyendo la fijación y la incubación con anticuerpos, para revelar los resultados de tinción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- La inmunohistoquímica en montaje completo permite el estudio de la distribución de antígenos en embriones.
- Esta técnica fue introducida originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell.
- Proporciona información sobre los procesos del desarrollo y la expresión génica.
- Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP mejoran la visualización de los antígenos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento de inmunohistoquímica en preparación completa.
- Visualizar la expresión de antígenos en embriones de pollo.
- Comparar las ventajas de este método frente a las técnicas con anticuerpos fluorescentes.
Métodos Utilizados
- Fijación de embriones en paraformaldehído.
- Supresión de la actividad peroxidasa endógena.
- Incubación en anticuerpos primarios y secundarios.
- Reacción de color revelada mediante sustrato DAB para visualización.
Resultados principales
- La tinción con anticuerpos aparece naranja, lo que indica una detección exitosa del antígeno.
- Los embriones pueden procesarse para seccionado en parafina tras la tinción.
- Este método permite estudios en sección transversal de los sitios antigénicos.
- Demuestra la eficacia de los anticuerpos conjugados con HRP en la tinción.
Conclusiones
- La inmunohistoquímica en montaje completo es una técnica valiosa para el estudio de embriones de pollo.
- Permite una visualización clara de los patrones de expresión de antígenos.
- El método es ventajoso para el análisis histológico posterior.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmunohistoquímica en preparaciones completas en embriones de pollo permite la cartografía espacial de la expresión de antígenos, apoyando la validación de dianas en neurociencia del desarrollo. El método proporciona una reducción mecanicista de riesgos al vincular dianas moleculares con resultados fenotípicos en un sistema relevante para la enfermedad. La compatibilidad con el corte en cera permite a los equipos multidisciplinarios correlacionar datos de inmunohistoquímica con análisis histológico, mejorando la continuidad traslacional en la evaluación preclínica de dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la distribución del antígeno en el tubo neural y los somitos en desarrollo.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la observación directa del acoplamiento al blanco en embriones intactos.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en el blanco al proporcionar datos de expresión con resolución espacial para la identificación de compuestos líderes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera patrones de tinción estandarizados y reproducibles utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP y sustrato DAB.
- Resultado cuantitativo: Permite la evaluación semicuantitativa de sitios antigénicos mediante la intensidad del color, apoyando la optimización del ensayo.
- Reutilización de plataforma: Compatible con seccionado en parafina, permitiendo que la misma muestra teñida sirva para múltiples flujos de trabajo analíticos posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable al estudio de los efectos embriotóxicos de compuestos, como fármacos antiepilépticos, en un modelo vertebrado.
- Continuidad traslacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al permitir el seguimiento consistente de antígenos en formatos de montaje completo y seccionados.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Aclara si los fenotipos observados se correlacionan con la modulación del objetivo en tejidos en desarrollo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la secuencia de descubrimiento a preclínico, apoyando las etapas iniciales de validación del blanco y desarrollo de ensayos antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al revelar la expresión antigénica espacio-temporal en el cerebro en desarrollo y en el tubo neural.
- Selección: Proporciona lecturas inmunohistoquímicas estandarizadas que apoyan la evaluación reproducible de compuestos en sistemas embrionarios.
- Análisis: Genera una señal cromogénica detectable mediante microscopía de campo claro, lo que permite el análisis cuantitativo de imágenes para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores al permitir la validación de la localización antigénica tanto en preparaciones enteras como en cortes histológicos.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma reutilizable con capacidad de histología, aplicable en múltiples proyectos que estudian toxicidad del desarrollo o expresión de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la presencia de antígenos con estructuras embrionarias específicas.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de fijación, bloqueo e incubación con anticuerpos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar confirmación histológica de la modulación del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles de interacción con blancos en desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de embriones, inmunohistoquímica y detección cromogénica.
- Depende del acceso a microscopios, mutadores y ventilación para el manejo de DAB y H2O2.
- Necesita la estandarización de la dilución de anticuerpos y de los protocolos de lavado entre los equipos.
- La adaptación a otras especies puede requerir la optimización de los pasos de permeabilización y bloqueo.
- Las limitaciones prácticas incluyen tiempos de incubación más largos y la necesidad de desechar cuidadosamente el DAB para prevenir artefactos.
