Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

El procedimiento comienza con la anestesia del ratón y la preparación del sitio quirúrgico. A continuación, el ratón se coloca boca abajo sobre el instrumento estereotáxico. Se realizó una incisión sagital de la piel por debajo del occipucio y el tejido subcutáneo y los músculos del cuello a través de la línea media se separaron sin rodeos.

A continuación, se coloca la parte posterior del cuerpo de forma que el cuerpo forme un ángulo de 135 grados con la cabeza fija, se penetra la duramadre del esternón magna CI con el capilar de vidrio y se recogerá el líquido cefalorraquídeo. Después de la toma de muestras de LCR, se realinean los músculos y se sutura la piel, se inyecta por vía subcutánea aproximadamente un mililitro de solución salina al 0,9% de NACL para evitar la deshidratación y se mantiene caliente al ratón hasta que se recupere. Hola, mi nombre es Liu y pertenezco al laboratorio de la Dra. Karen Duff en el Instituto Superior de la Universidad de Columbia.

Hoy te mostraré cómo recolectar líquido espinal cerebral del sistema mag del ratón. Con esta técnica, podemos recolectar muestras seriadas de LCR hasta tres veces del mismo ratón con un intervalo de dos a tres meses. En nuestro laboratorio, utilizamos esta técnica para determinar los niveles de CSFA beta o tau a diferentes edades de nuestros modelos de ratones transgénicos de la enfermedad de Alzheimer y correlacionamos estos valores con los del cerebro.

Por último, estamos interesados en el potencial de los niveles de CSFA beta o tau como potenciales marcadores biológicos para la progresión de la enfermedad y también para los ensayos terapéuticos en ratones. Así que comencemos. Para este procedimiento, es necesario hacer capilares con una micro pipeta polar.

Los capilares utilizados aquí son vidrio de silicato BOA B 175 10 de Sutter Instruments tira de los capilares en una micropipeta flameada Sutter P 87 polar con el índice de calor ajustado a 300 y el índice de presión a tres 30. El capilar de vidrio mide cinco centímetros de largo y tiene una punta cónica. La punta del capilar se recorta con unas tijeras para que su diámetro interior sea de unos 0,5 milímetros.

El procedimiento quirúrgico comienza con anestesiar al ratón con ketamina 100 miligramos por kilogramo y xilacina 10 miligramos por kilogramo administrados intraperitoneal durante la anestesia, manteniendo al ratón caliente en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de determinar que el animal está completamente anestesiado con un reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie, pruebe el afeitado del cuello, luego coloque el mouse en el instrumento estereotáxico como este de David kink. En contacto directo con la almohadilla térmica, inserte una sonda de temperatura rectal para que el calor de la almohadilla se pueda ajustar de acuerdo con la temperatura corporal del mouse.

Asegure la cabeza con los adaptadores de cabeza, frote la piel del cuello con yodo al 10% de povidona y etanol al 70% tres veces y haga una incisión sagital inferior a la porción posterior de la cabeza u occipucio. Los siguientes pasos deben realizarse bajo un microscopio de disección con pinzas romas. Separe el tejido subcutáneo y los músculos M por ventor y M recto cabeza dorsal mayor para que la duramadre del esternón magna quede expuesta Utilice adecuadamente un par de microrretractores para mantener los músculos separados.

Finalmente, coloque el mouse con la cabeza en un ángulo de 135 grados con respecto al cuerpo. El ratón ya está listo para la recogida de CSF. Esta técnica de recolección de LCR del esternón Magno fue publicada anteriormente.

C figura uno A bajo el microscopio de disección. La duramadre aparece como un triángulo inverso brillante y claro a través del cual son visibles el bulbo raquídeo y un vaso sanguíneo principal. Arteria espinela dural C figura uno B.Se puede observar la pulsación circulatoria de la médula y el espacio adyacente al LCR.

Secar la duramadre con un hisopo de algodón estéril, penetrar el capilar en el esternón magna CI a través de la duramadre lateral a las espinelas de la arteria dorsal. Habrá un cambio notable en la resistencia cuando el capilar se inserte correctamente y el LCR fluirá hacia el capilar. Una vez que se haya recolectado el líquido cefalorraquídeo, retire cuidadosamente el capilar y conéctelo con una jeringa de tres mililitros utilizando un tubo de polietileno que tenga un diámetro interno de un milímetro.

Inyecte el líquido cefalorraquídeo en un tubo de 0,5 mililitros. Etiquete el tubo y congélelo inmediatamente sobre hielo seco. Una vez congelado, transfiera el líquido cefalorraquídeo a un congelador a menos 80 grados centígrados.

La técnica de muestreo que acabamos de demostrar es extremadamente suave y permite tomar muestras posteriores de LCR del mismo ratón durante un intervalo de dos a tres meses. Por lo tanto, después de tomar muestras del cuello, los músculos y la piel deben realinearse y cerrarse con suturas. Después de suturar la incisión, inyecte aproximadamente un mililitro de solución salina al 0,9% de NACL por vía subcutánea para rehidratar al ratón.

Mantenga el ratón calentado a unos 37 grados centígrados hasta que se recupere. Controle su peso al primer día y al séptimo día después de la cirugía. Acabo de mostrarle cómo recolectar líquido cefalorraquídeo del sistema mag del ratón.

Al realizar este procedimiento, hay tres cosas importantes que debe recordar. Primero, coloque la cabeza y el cuerpo del mouse correctamente en el marco estereotáctico para que el ator del Cy Magna pueda exponerse tanto como sea posible. En segundo lugar, evite cuidadosamente los vasos sanguíneos cuando penetre en el durómetro con capilar.

De lo contrario, la muestra se contaminará con la sangre. Por último, pero no menos importante, recuerde mantener a sus ratones calientes durante todo el procedimiento para evitar la hipotermia. La hipotermia no solo es dañina para los ratones, sino que también puede afectar significativamente sus resultados al inducir una producción beta o una relación de hipofosforilación alta.

Está bien, eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.