Name: Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende una técnica refinada para la recolección seriada de líquido cefalorraquídeo en ratones transgénicos de Alzheimer. Este método permite monitorear biomarcadores como Aβ y tau longitudinalmente.

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Nuestro trabajo es apoyado por el NIH subvenciones NS048447 y KD AG017216to. Li Liu gustaría agradecer al Dr. Heikki Tanila (Universidad de Kuopio, Kuopio, Finlandia) para su supervisión y apoyo durante el desarrollo del protocolo original.

Tirar del tubo capilar de vidrio <ol><li> El tubo capilar de vidrio se compra a La Inc Sutter Instrument (vidrio borosilicato, B100-75-10). </li><li> Tire de los tubos capilares en un Sutter P-87 Flaming micropipeta extractor, con el índice de calor en 300 y el índice de presión de 330. </li><li> Recorte el extremo del tubo capilar de vidrio con unas tijeras, de modo que la punta cónica tiene un diámetro interior de 0,5 mm. </li></ol> Cisterna magna técnica de punción de líquido cefalorraquídeo Muestras de LCR se han tomado de la cisterna magna (Figura 1) utilizando un método que se publicó anteriormente 1. <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="Diagrama de anatomía cerebral: cerebelo, cisterna magna, corteza, etiquetas de tronco encefálico." width="432" height="184" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 1. Los ratones son anestesiados por la ketamina (100mg/kg) y xilazina (10mg/kg), administrado por vía intraperitoneal. En el momento de la inducción de la anestesia, los ratones se mantienen en una incubadora a 37 ° C. 2. La piel del cuello se afeita, y el ratón se coloca boca abajo en el instrumento estereotáxico con el contacto directo de una almohadilla eléctrica. Una sonda de temperatura rectal se inserta en el recto para que el calor producido por la almohadilla se ajusta en respuesta a los cambios de la temperatura corporal. La cabeza está protegida con los adaptadores de la cabeza. El lugar de la cirugía se limpia con povidona yodada al 10%, seguido por 7 0% de etanol (repetir 3 veces), y una incisión sagital de la piel se hace inferior a la protuberancia occipital. 3. Bajo el microscopio de disección, el tejido subcutáneo y músculos (m. Biventer cervicis de m. recto dorsal mayor capitis) son separados por una disección roma con una pinza. Un par de microretractors se utiliza para mantener los músculos de distancia. 4. El ratón se establece de manera que la cabeza forma un ángulo de casi 135 o con el cuerpo. 5. Bajo el microscopio de disección, la duramadre de la cisterna magna se presenta como un triángulo inverso brillante y clara a través del cual el bulbo raquídeo y un vaso sanguíneo principal (arteria espinales dorsales), y el espacio del LCR son visibles (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="Demostración de anatomía quirúrgica; procedimiento de disección; exposición tisular; fines educativos." width="304" height="307" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 6. La duramadre es borrado en seco con un hisopo de algodón estéril. Penetrar en el tubo capilar en el Citerna magna a través de la duramadre, lateral a la arteria espinales dorsales (Figura 2). Después de un cambio notable en la resistencia a la inserción de un tubo capilar, el LCR fluye dentro del tubo capilar. 7. Retire con cuidado el tubo capilar, y conectarlo a una jeringa de 3 ml a través de un tubo de polietileno que tiene un diámetro interno de 1 mm. Inyectar el líquido cefalorraquídeo en un pre-marcadas tubo eppendorf de 0,5 ml y congelar inmediatamente el tubo en hielo seco y luego la transfiere en una -80 ° C congelador. 8. Después de tomar muestras de LCR, los músculos se vuelven a alinear, y la piel se sutura (4-0, Ethicon, Johnson &amp; Johnson). Aproximadamente 1 ml de NaCl al 0,9% que se inyecta por vía subcutánea para evitar de deshidratación. El ratón se mantiene en la incubadora para mantener la temperatura corporal hasta que se recupere, el peso del ratón se controla un día y una semana después de la cirugía. Resultados y Discusión Se describe un protocolo de alta fiabilidad para la toma de muestras de LCR en serie de los ratones sin contaminación detectable en plasma. 1. El procedimiento completo generalmente toma 10 minutos por ratón (incluyendo la anestesia). El volumen de líquido cefalorraquídeo obtenido depende de las cepas de ratones. En el PS / APP ratones Tg doble usamos 2, el volumen promedio es de aproximadamente 5 l (3 a 7 l), mientras que el P301L (JNPL3) 3 ratones dan un rendimiento de alrededor de 10 l-15 l. Para el muestreo de serie, un máximo de 8.7 l puede tomar de manera segura cada vez que en un intervalo de 2-3 meses. 2. Durante la cirugía, es importante la posición de la cabeza y el cuerpo del ratón correctamente en el marco estereotáxico para que la duramadre de la cisterna magna puede estar expuesto lo suficiente. Evita cuidadosamente los vasos sanguíneos cuando penetra en la duramadre con el tubo capilar para prevenir la contaminación de las proteínas plasmáticas, que pueden ser monitoreados en la muestra de LCR por inmunotransferencia de ApoB 4. 3. Reducir al mínimo el daño a los tejidos durante cada cirugía es importante, ya que conglutinación tejido puede aumentar la dificultad por el sangrado de predisposición para la toma de muestras siguientes. 4. La temperatura del cuerpo necesita para mantenerse en buen estado durante la cirugía debido a una hipotermia causada por la anestesia puede afectar significativamente los niveles de tau fosforilada en el cerebro muy rápidamente 5. 5. El Ab ELISA protocolo y los anticuerpos que se utilizaron fueron descritas en detalle en Refolo et al. 6. Dos l de líquido cefalorraquídeo de los ratones PS / APP dará resultados satisfactorios cuando se diluye 1:50-1:60. ELISA para la tau, 4-5 l de LCR P301L (JNPL3) los ratones será suficiente para lala detección del total de tau, tau o fósforo ylated en treonina 231 (Los kits son adquiridos de Bio-Fuente). 6. Esta técnica se puede aplicar a otros modelos de ratón de las enfermedades neurológicas, por lo que un pequeño volumen de LCR es satisfactorio para los ensayos que desee.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

Se describe un protocolo de alta fiabilidad para la toma de muestras de LCR en serie de los ratones sin contaminación detectable en plasma. 1. El procedimiento completo generalmente toma 10 minutos por ratón (incluyendo la anestesia). El volumen de líquido cefalorraquídeo obtenido depende de las cepas de ratones. En el PS / APP ratones Tg doble que used2, el volumen promedio es de aproximadamente 5 l (3 a 7 l), mientras que el P301L (JNPL3) 3 ratones dan un rendimiento de alrededor de 10 l-15 l. Para el muestreo de serie, un máximo ...

una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que es caracterizada patológicamente por depósito extracelular de péptidos β-amiloide (Aß) y la acumulación intraneuronal de proteína tau hiperfosforilada. Debido a que el líquido cefalorraquídeo (LCR) está en contacto directo con el espacio extracelular del cerebro, que proporciona un reflejo de los cambios bioquímicos en el cerebro en respuesta a procesos patológicos. LCR de pacientes con EA muestra una disminución de los 42 aminoácidos forma de Aß (Aß42), y el aumento de tau total y tau hiperfosforilada, aunque los mecanismos responsables de estos cambios aún no se entienden completamente. Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el LCR cambio a medida que progresa la enfermedad. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de la enfermedad por el ratón. Esta técnica de muestreo muy suave permite que las muestras de LCR en serie que se obtenga de el mismo ratón a intervalos de 2-3 meses, que minimiza en gran medida el efecto de confusión de la variabilidad entre el ratón en los niveles de Aß o tau, por lo que es posible detectar alteraciones sutiles en el tiempo. En combinación con Aß y ELISA tau, esta técnica será útil para los estudios diseñados para investigar la relación entre los niveles de CSF Aß42 y tau, y su metabolismo en el cerebro en modelos de ratón de Alzheimer. Los estudios en ratones Tg podría proporcionar validación importante en cuanto a la posibilidad de Aß CSF o los niveles de tau para ser utilizados como marcadores biológicos de progresión de la vigilancia de las enfermedades, y para controlar el efecto de las intervenciones terapéuticas. Como los ratones pueden ser sacrificados y los cerebros pueden ser examinadas por los cambios bioquímicos o histológicos, los mecanismos subyacentes a los cambios del LCR puede ser mejor evaluado. Estos datos pueden ser de carácter informativo para la interpretación de los cambios humanos AD CSF.

Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF ​​conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva que se caracteriza patológicamente por el depósito extracelular de &#946;-amiloide...

El procedimiento comienza con la anestesia del ratón y la preparación del sitio quirúrgico. Luego, el ratón se coloca en posición prona sobre el instrumento estereotáxico. Se realiza una incisión sagital de la piel por debajo del occipucio y se separa por disección roma el tejido subcutáneo y los músculos del cuello a través de la línea media.Luego, se coloca la parte posterior del cuerpo de forma que el cuerpo forme un ángulo de 135 grados con la cabeza fija, se penetra la duramadre del agujero occipital con la micropipeta de vidrio y se recoge el LCR. Después de la extracción del LCR, los músculos se reacomodan y la piel se sutura; se inyecta aproximadamente un mililitro de solución salina 0.9 %NACL subcutáneamente para prevenir la deshidratación y el ratón se mantiene caliente hasta que se recupere. Hola, mi nombre es Liu, del laboratorio de la Dra. Karen Duff en el Instituto Superior de la Universidad de Columbia.Hoy les mostraré cómo recolectar líquido cefalorraquídeo del sistema mag del ratón. Con esta técnica, podemos obtener muestras seriadas de LCR hasta tres veces del mismo ratón, con intervalos de dos a tres meses. En nuestro laboratorio, utilizamos esta técnica para det

a-technique-for-serial-collection-cerebrospinal-fluid-from-cisterna

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Joshi, K., et al. Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna en ratones. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el enfoque estereotáxico de la cisterna magna para la administración dirigida al tronco encefálico y la médula espinal superior. Al acceder a la cisterna magna llena de líquido cefalorraquídeo, este enfoque permite inyecciones precisas en áreas que son difíciles de...

Enfoque estereotáxico de cisterna magna para la administración terapéutica en un modelo de ratón

Fuente: Zamboni, M., et al., Inducción de la modificación de las células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento de administración de un fármaco inductor en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La inyección induce selectivamente la expresión de marcadores fluorescentes en las células de la superficie cerebral accesibles a través del líquido cefalorraquídeo, confirmado por imágenes de fluorescencia.

Administración dirigida de fármacos en un modelo de ratón mediante inyección de cisterna magna

Fuente: Xavier, A. L. R., et al. Implantación de cánula en la cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra el procedimiento para implantar una cánula en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La técnica consiste en guiar una cánula montada con aguja a través de la duramadre hacia la cisterna magna triangular invertida y asegurarla para su administración dirigida al líquido cefalorraquídeo.

Implantación de cánula en la cisterna magna en un modelo de ratón

En este video, describimos el procedimiento para introducir células tumorales de origen humano en la cisterna magna del cerebro de un ratón. El modelo ortotópico de ratón se puede utilizar para estudiar la diseminación metastásica del cáncer a las meninges craneales.

Inyección quirúrgica de cisterna magna: un método para administrar células tumorales directamente en el sistema nervioso central de un modelo murino

Fuente: Sweeney, A. M., et al. Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo a través del cráneo de ratón intacto mediante macroscopía de fluorescencia. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el proceso de visualización del flujo de líquido cefalorraquídeo (LCR) en un cerebro de ratón mediante imágenes de fluorescencia. Se inyecta un marcador fluorescente en la cisterna magna (CM), lo que permite rastrear su movimiento con LCR a través de los espacios subaracnoideos y...

Imágenes in vivo del transporte de líquido cefalorraquídeo en un cerebro de ratón mediante macroscopía de fluorescencia

Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

Aquí se describe un protocolo para realizar la canulación de cisterna magna (CMc), una forma mínimamente invasiva para ofrecer marcadores, sustratos y moléculas de señalización en el líquido cerebroespinal (CFS). Combinado con diferentes modalidades de imágenes, CMc permite sistema de glymphatic y evaluación dinámica de CSF, así como entrega de todo el cerebro de varios compuestos.

Implantación de la cánula en la Cisterna Magna de roedores

Las imágenes ópticas transcraneales permiten imágenes de campo amplio del transporte de líquido cefalorraquídeo en la corteza de ratones vivos a través de un cráneo intacto.

En Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.

Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

Aprende una técnica refinada para la recolección seriada de líquido cefalorraquídeo en ratones transgénicos de Alzheimer. Este método permite monitorear biomarcadores como Aβ y tau longitudinalmente.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

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