Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)

Este procedimiento comienza con el aislamiento de los ganglios simpáticos cervicales superiores de ratas neonatales P cero. Cada cerebro tiene dos ganglios simpáticos cervicales superiores. Aproximadamente 24 ganglios pueden obtenerse de una camada única de crías de rata.

La disociación de los ganglios comienza con viajes y un tratamiento durante 30 minutos. La disociación posterior se logra mediante repeticiones sucesivas con una pipeta de vidrio pulida al fuego, obteniéndose una suspensión de células individuales. A continuación, se siembran neuronas simpáticas en placas recubiertas con colágeno ENC.

Hola, soy Nila Zurin del laboratorio del Dr. Lloyd Green en el Departamento de Patología y Biología Celular de la Universidad de Columbia. Hoy demostraremos cómo aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de los ganglios cigomáticos superiores de crías rojas recién nacidas. En nuestro laboratorio, normalmente utilizamos estas células para estudiar la apoptosis en respuesta a la retirada del factor de crecimiento nervioso.

Así que comencemos. Iniciamos el procedimiento recubriendo un plato de cultivo con colágeno de cola de rata 24 horas antes de realizar la disección. Dependiendo de la naturaleza del experimento, se utiliza una placa de cultivo de 24 o 48 pozos.

A continuación se prepararán los medios y equipos de solución. Estos materiales y reactivos pueden encontrarse en el protocolo escrito que acompaña a este video. Es importante tener en cuenta que la solución de uridina y cinco FDU debe prepararse justo antes de su uso.

Continúe la preparación con fuego. Pulido de las pipetas de pasteur de vidrio para los pasos de tación. La punta de la pipeta de vidrio se mantiene en la llama durante unos segundos mientras se gira para estrecharla y alisarla.

El pulido inicial con llama debe realizarse en una cabina de cultivo celular estéril. Para comenzar la disección, recolecte crías de rata neonatal P cero a P uno. Una cría de rata neonatal se limpia rápidamente con etanol al 70 % para reducir la contaminación.

Tras la decapitación, la cabeza se coloca sobre la almohadilla de disección con el lado ventral hacia arriba y el extremo del cuello orientado hacia usted. Debe ser fácilmente visible la tráquea seccionada. Se utilizan agujas estériles de jeringa para fijar la cabeza seccionada a la almohadilla de disección de la siguiente manera.

Introduzca un alfiler a través del paladar hacia el soporte y coloque el segundo alfiler a través de la médula espinal seccionada hacia el soporte. Después de colocar la platina de disección bajo el microscopio y mirar a través de los oculares, utilice dos pares de pinzas para retirar la piel y la grasa alrededor de la tráquea. Teniendo cuidado de no profundizar demasiado, se expondrá un par de músculos que corren casi paralelos entre sí a ambos lados de la tráquea.

Durante la disección, será necesario irrigar con PBS estéril frío o medio RPMI 1640 frío sin suero, administrado con una pipeta Pasteur estéril, para eliminar la sangre en exceso. Esto puede hacerse una vez o más de una vez, dependiendo de la velocidad del trabajo. Luego, se utilizan las pinzas para cortar y retirar el músculo primero de un lado.

Una vez que se ha extraído el músculo, la arteria carótida quedará visible. Esta arteria discurre junto a la tráquea y se bifurca formando una estructura que parece una cinta con forma de Y. Esta bifurcación constituye un punto de referencia importante, y una vez localizada, será relativamente fácil encontrar los ganglios cervicales superiores.

La arteria se secciona en el extremo más cercano y se levanta ligeramente con la pinza. El otro extremo de la arteria permanece unido. Una vez realizado esto, el ganglio cervical superior quedará visible.

Se debe observar que tiene forma de almendra, aparece como una pequeña masa de tejido brillante unida laxamente a la arteria en el punto de bifurcación, y presenta conectores preganglionares y/o posganglionares similares a hilos. Se utiliza un segundo par de pinzas para separar suavemente el ganglio cervical superior y colocarlo en una pequeña placa de cultivo de 35 milímetros que contiene medio RPMI 1640 frío sin suero. A continuación, se extrae el ganglio del otro lado de la tráquea siguiendo el mismo protocolo.

Una vez que todos los ganglios han sido disecados, se liberan lo más posible del tejido extraño. Al observar a través del microscopio, se puede notar que los ganglios tienen adheridos fragmentos de grasa de la arteria carótida u otros tejidos; se utilizan pinzas para separar estos materiales no deseados. También se recortan los conectivos pre y/o posganglionares.

Cada ganglio tiene aproximadamente 10.000 neuronas. Una vez que las neuronas se siembran, regenerarán sus neuronas limpias. Luego, los ganglios se colocan en un tubo cónico estéril de polipropileno de 15 mililitros que contiene medio RPMI 1640.

A continuación, se establece el cultivo de neuronas simpáticas. Los ganglios se centrifugan a 200 G durante dos minutos y se descarta el sobrenadante. Los ganglios se resuspenden en 0,5 a un mililitro de solución de tripsina al 0,25 % y luego se colocan en un baño de agua o incubadora a 37 grados Celsius durante 30 minutos para facilitar la disociación de las células en los ganglios.

Después de 30 minutos, se añaden 10 mililitros de medio completo para diluir y neutralizar la tripsina. Las soluciones se centrifugan entonces a 200 ×g durante dos minutos. Se descarta el sobrenadante y los ganglios se resuspenden en dos mililitros de medio final.

Utilizando una de las puntas de pipeta previamente preparadas y pulidas al fuego con una abertura ancha, las células se disocian aún más pasando los ganglios hacia arriba y hacia abajo 20 veces. Luego, el tubo se coloca sobre hielo durante unos minutos. A continuación, la punta de pipeta se pule nuevamente al fuego para hacer la abertura aún más estrecha.

Después de que la pipeta se enfríe, los ganglios se trituran otras 20 veces. El medio se volverá progresivamente más turbio, lo que indica que las células se están disociando. Este paso se repite una o dos veces más, dependiendo de qué tan bien se disocien las células.

Después de cierto tiempo, los ganglios se habrán disociado en neuronas y no serán visibles ganglios intactos en el tubo. Puede haber algo de material tisular que en este punto no se disocie. Se deja el tubo reposando en hielo durante unos minutos para que cualquier resto no asociado se sedimente en el fondo.

Se recoge cuidadosamente todo el sobrenadante excepto aproximadamente 50 microlitros, que se coloca en otro tubo. Se dejan 50 microlitros en el fondo del tubo para evitar la transferencia de restos no asociados. Se añade más medio final al tubo que contiene las células disociadas.

El volumen del medio final añadido depende del tipo de placa de cultivo que se utilice para cultivar las neuronas. Por ejemplo, si se va a emplear una placa de 24 pocillos, entonces siembre un ganglio por pocillo en 0.5 mililitros de medio final por pocillo.

Una camada típica de ratas consta de 12 crías, lo que proporcionaría 24 ganglios. Esto es suficiente para sembrar una placa de 24 pocillos, y el volumen total del medio final es de 12 mililitros. El uso de uridina cinco FDU en el medio final evitará la proliferación y promoverá la muerte de una pequeña población de células gliales y otros tipos celulares.

En el cultivo, las células se alimentan cada 48 horas reemplazando dos tercios del medio. Con RPMI fresco más 1 % de suero de caballo más NGF y uridina y cinco FDU. Al principio, el cultivo contiene neuronas simpáticas que se ven redondas sin neuronas.

Las neuronas cortas se vuelven visibles 24 horas después de la disección y progresivamente se hacen más densas y ramificadas con el tiempo. Acabamos de mostrarle cómo aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de los ganglios cervicales superiores de ratones recién nacidos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar primero, tomarse el tiempo y tener cuidado al limpiar los ganglios, eliminando todos los restos, vasos sanguíneos y grasa.

Este paso es importante para garantizar un cultivo más o menos homogéneo y libre de tipos celulares extraños. En segundo lugar, durante el paso de disociación, sea paciente y tómese el tiempo necesario para separar las neuronas de modo que no se encuentren en grandes agregados. Una vez que se asienten en las placas, los grandes agregados dificultarán el proceso.

En aplicaciones posteriores, como la transección o la infección de las neuronas, la tinción inmunológica también podría verse dificultada, y cualquier experimento que requiera el conteo de neuronas será difícil de realizar. Por último, no es necesario suplementar el medio con penicilina-estreptomicina. Cada vez que se alimentan las cultivos, basta con añadir penicilina-estreptomicina únicamente la primera vez que se siembran las células.

Agregue uridina cinco FDU fresca al medio cada vez que se cambie el medio. Nuestro laboratorio ha utilizado cultivos de neuronas simpáticas para estudiar la apoptosis en respuesta a la retirada del factor de crecimiento nervioso. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.