Name: Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprende a aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de ganglios cervicales superiores de ratas recién nacidas. Este protocolo enzimático permite obtener cultivos viables para estudios de neurobiología y apoptosis.

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NZ gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Subhas Biswas, Andrew Sproul, y Willet Ryan por su formación en la disección y la cosecha de las neuronas simpáticas. Apoyado por becas de los NIH, NINDS.

1. Preparación para la disección: <ol><li> Seleccione la placa de cultivo apropiado (10 cm o placas de 6 pocillos o bien 24, etc) dependiendo de la naturaleza de sus experimentos, y el escudo con el colágeno de cola de rata-24 horas antes de la disección. Los métodos para la preparación de cola de rata colágeno y usarlo para placas de cultivo abrigo se han descrito en otra parte (1). </li><li> Prepare una solución de tripsina 0,25% en tampón fosfato salino (PBS) (sin EDTA) y el filtro de esterilización. Preparar alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 º C. </li><li> Prepare una solución que contiene 2.5 mM de cada uno de uridina y 5 FDU-en agua destilada / desionizada H 2 O. Filtro a esterilizar y preparar alícuotas de 50 microlitros. Conservar a -20 º C. </li><li> Preparar medio completo: RPMI 1640 medio de cultivo con 10% inactivado por calor suero de caballo (el calor inactiva por incubación en un baño de agua a 56 º C durante 30 minutos) y el 5% de suero fetal bovino. </li><li> Prepare final Medium: RPMI 1640 medio de cultivo con 1% inactivado por calor suero de caballo + NGF (concentración 100ηg/ml final) + penicilina / estreptomicina (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solución (10 mM concentración final) . Nota: este medio debe estar compuesto por nuevos antes de su uso en todo momento. Para un experimento en un formato de placa de 24 pozos, uno tendrá que preparar 12 ml de este medio. Se recomienda que se prepare un poco más. NGF se pueden comprar en una variedad de fuentes comerciales (véase el cuadro al final de este protocolo). </li><li> Equipamiento: Un necesita un microscopio de disección y fuente de luz. Un iluminador de cuello de cisne de fibra óptica doble con puntas de enfoque es preferible. Además, será necesario limpiar y esterilizar (autoclave o por inmersión en etanol al 70% por lo menos 20 minutos) las herramientas de disección: dos pares de micro-disección pinzas de acero inoxidable, y un par de tijeras de disección (también de acero inoxidable y tanto desde Roboz). Dos agujas de jeringas estériles (26 gague x 1 ½ pulgadas o similar) también será necesario. Es necesario establecer una tabla de disección, que es un 3 &quot;x3&quot; pedazo de espuma de poliestireno envueltos en papel de aluminio y cubierta con una Kimwipe. Rocíe el tablero con etanol al 70% para descontaminar. Por último, la preparación del fuego pulido pipeta de vidrio de los pastos. Con el fin de pulir al fuego, tomar la pipeta de vidrio y sostenga la punta de la llama durante unos segundos, durante la rotación. Tras la inspección, la punta se verá más suave y la apertura será más estrecho. Esto es necesario para el paso en el que las células se disocian. Realizar fuego pulido en una campana de cultivos celulares para que la pipeta se mantiene estéril. </li></ol> 2. La disección del ganglio cervical superior: <ol><li> Recoger cachorros recién nacidos de ratas que están en edad de P0 o P1. </li><li> Limpie rápidamente el cachorro para la disección con el 70% de etanol para reducir las posibilidades de contaminación. </li><li> Rápidamente decapitar a las crías con un par de tijeras afiladas (este paso no se muestra en el video). Mantenga la cabeza con una pinza estéril contra una gasa estéril para drenar el exceso de sangre brevemente. </li><li> Coloque la cabeza sobre la almohadilla de la disección con la parte ventral hacia arriba y el extremo caudal orientada hacia usted. La tráquea cortada debe ser fácilmente visible. Use las agujas de jeringas estériles para asegurar la cabeza cortada a la plataforma de la disección de la siguiente manera: empujar una de las patas cuando el techo de la boca en la almohadilla y empuje el pasador de segundo, aunque la tráquea cortada en la almohadilla. Coloque la almohadilla bajo el microscopio de disección y comenzar la disección. </li><li> Usando ambas pinzas (una en cada mano) la piel clara de distancia y la grasa alrededor de la tráquea, teniendo cuidado de no profundizar demasiado. Haciendo esto expondrá un par de músculos que van casi en paralelo el uno al otro a ambos lados de la tráquea. Nota: durante la disección, tendrá que regar con agua fría o caliente PBS estéril, libre de suero RPMI 1640 que entrega con una pipeta Pasteur para quitar el exceso de sangre y para mantener el área limpia y húmeda. Esto se puede hacer sólo una vez o varias veces dependiendo de la velocidad se trabaja. Por un disector de la experiencia, sólo se tarda de dos a tres minutos para diseccionar un par de ganglios. </li><li> Use las pinzas para cortar y extirpar el músculo en un lado primero. </li><li> Una vez que el músculo se elimina, la arteria carótida se hará visible. A menudo, es la luz rosada y contiene la sangre. Puede aparecer un color más claro que otros vasos sanguíneos que puede ver en los alrededores y por esta razón, la arteria carótida puede no ser evidente de inmediato. Esta arteria corre a lo largo de la tráquea y se bifurca en lo que parece una &quot;Y&quot; en forma de cinta. Esta bifurcación es un hito importante y una vez que se encuentra, será relativamente fácil encontrar el SCG. </li><li> Cortar la arteria en el extremo más caudal y subirlo un poco con la pinza (el otro extremo todavía está conectado). Una vez hecho esto, podrás ver una forma de almendra, brillante en masa buscando pequeñas de tejido que se unen libremente a la arteria justo en el punto de bifurcación y que ha tread-como pre-y / o post-ganglionares de enlace. Este es el ganglio cervical superior. Use un segundo par de pinzas en la otra mano para separar suavemente y colóquelo en un plato de cultivo pequeño (35 mm) con frío, el suero libre de RPMI 1640. </li><li> A continuación, extraer el ganglio en el otro lado de la tráquea, siguiendo el mismo protocolo. </li></ol> 3. Limpieza de los ganglios: <ol><li> Una vez que todos los ganglios han sido diseccionados, que debería ser liberado lo más posible de tejido extraño. </li><li> Bajo el microscopio de disección, se puede ver que los ganglios se han unido las piezas de la arteria carótida, el tejido adiposo o de otro tipo. Trabajar con fórceps en cada mano para burlarse de distancia estos materiales no deseados. Lugar limpiar los ganglios en una estéril cónicos 15 ml, tubo de polipropileno, que contiene medio RPMI 1640. </li><li> Los conectores pre-y / o post-ganglionares también debe ser recortada. Cada ganglio tiene alrededor de 10.000 neuronas. Una vez que las neuronas están recubiertos, que volverá a crecer sus neuritas. </li></ol> 4. El establecimiento de la cultura neuronas simpáticas: <ol><li> Centrífuga de los ganglios en 200xg durante 2 minutos y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender los ganglios en 0,5 a 1 ml de solución de tripsina 0,25%. Colocar en un baño de agua a 37 ˚ C o una incubadora durante 30 minutos. Esto le ayudará a disociar las células de los ganglios. </li><li> Después de 30 minutos, agregar 10 ml de medio completo para diluir y neutralizar la tripsina y centrifugar a 200xg durante 2 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de medio final. </li><li> Además se disocian las células de trituración de los ganglios arriba y hacia abajo con el fuego-pulido pipeta de vidrio de los pastos. Triturar los ganglios de 20 veces y colocar el tubo en hielo durante unos minutos. </li><li> Mientras tanto, el fuego a pulir la pipeta más para hacer la abertura más estrecha (aproximadamente 2 / 3 y 1 / 2 mm de diámetro). Espere unos minutos hasta que se enfríe y triturar los ganglios 20 veces más. A medida que continúe el medio serán cada vez más nublado que indica que las células se están disociados. Repita este paso una o dos veces más, dependiendo de lo bien que las células se disocian. Después de algún tiempo, te darás cuenta de que todos los ganglios se han disociado en las neuronas de los ganglios y no intacto son visibles en el tubo. Puede haber un poco de material tejido que no se disocian. En este punto, el tubo se sientan en el hielo durante unos minutos para que todos los residuos no disociado puede asentarse en el fondo. Ahora, recoger cuidadosamente casi todo el medio de la parte superior y colocar en otro tubo. Para asegurarse de que no recogen los restos sin disociar, deje unos 50 l en la parte inferior del tubo. Añadir más de medio final al tubo que contiene las células disociadas: este volumen depende del tipo de una placa de cultivo se utiliza para la cultura de las neuronas. Por ejemplo: si un plato de 24 y se va a emplear, a continuación, la placa de 0,5 ganglios por pozo (~ 10.000 neuronas por pocillo) en 0,5 ml de medio final por pocillo. Una camada de ratas típica consta de 12 crías, lo que daría 24 ganglios. Esto es suficiente para sembrar un 24 y placa y el volumen total de medio final es de 12 ml. Nota: los ganglios también contienen una pequeña población de células gliales y otros tipos de células que estarán presentes en la cultura. Utilizando Uridine/5-FDU en el medio final evitará su proliferación y promover su muerte. </li><li> Alimentación de las celdas cada 48 horas mediante la sustitución de 2 / 3 de la media con un fresco RPMI% suero de caballo + NGF y uridine/5-FDU. Nota: Al principio, la cultura contiene las neuronas simpáticas que mirar a su alrededor sin neuritas. Neuritas cortas se hacen visibles 24 horas después de la disección y se tornan progresivamente más denso y ramificado en el tiempo. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Utilizamos ratas Sprague Dawley, de nuestras culturas. Tómese su tiempo y atención a la limpieza de los ganglios. Eliminar todos los restos, los vasos sanguíneos y grasa. Este paso es importante para asegurar una cultura que es más o menos homogénea y libre de los tipos de células extrañas. La adición de uridine/5-FDU gran medida eliminar cualquier resto de las células no neuronales (mitosis) contaminación de la cultura o al menos inhibir su proliferación. Además, durante el paso de la disociación, ser paciente y tomar el ti...

<table><tbody><tr><td>Pinzas, acero inoxidable n.º 5</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, DEAVER rectas con puntas afiladas y romas - cuchillas de 43 mm - 5,5</td><td>Herramienta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutamina</td><td>Reactivo</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Reactivo</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo donante</td><td>Reactivo</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Inactivar por calor incubando en baño de agua a 56&amp;#x00B0;C durante 30 minutos.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina sin EDTA</td><td>Reactivo</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; desoxiuridina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reactivo</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección y fuente de luz</td><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 15 ml</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Herramienta</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo ganglios cervical superior (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Los ganglios cervical superior (SCG) en las ratas son pequeños, brillantes, con forma de almendra estructuras que contienen las neuronas simpáticas. Estas neuronas proporcionan inervación simpática de la cabeza y el cuello y las regiones que constituyen una población bien caracterizados y relativamente homogénea (4). Las neuronas simpáticas dependen de factor de crecimiento nervioso (NGF) para el crecimiento de la supervivencia, diferenciación y axonal y de la amplia disponibilidad de NGF facilita su cultura y su manipulación experimental (2, 3, 6). Por estas razones, cultivos de neuronas simpáticas se han utilizado en una amplia variedad de estudios, incluyendo el desarrollo neuronal y la diferenciación, los mecanismos de muerte celular programada y patológica, y la transducción de señales (1, 2, 5 y 6). La disección de los SCG de ratas recién nacidas y las neuronas simpáticas de cultivo no es muy complicada y se puede dominar con bastante rapidez. En este artículo vamos a describir en detalle cómo diseccionar el SCG de crías de rata recién nacida y de utilizarlos para establecer cultivos de neuronas simpáticas. El artículo también se describen los pasos preparatorios y de los diversos reactivos y equipos que se necesitan para lograr este objetivo.

Este es un protocolo que describe cómo aislar y cultivar primaria neuronas simpáticas de los ganglios cervical superior (SCG) de las crías recién nacido.

Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)

Los ganglios cervicales superiores (GCS) en ratas son estructuras pequeñas, brillantes y con forma de almendra que contienen neuronas simpáticas. Estas neuronas proporcionan...

Este procedimiento comienza con el aislamiento de los ganglios simpáticos cervicales superiores de ratas neonatales P cero. Cada cerebro tiene dos ganglios simpáticos cervicales superiores. Aproximadamente 24 ganglios pueden obtenerse de una camada única de crías de rata.La disociación de los ganglios comienza con viajes y un tratamiento durante 30 minutos. La disociación posterior se logra mediante repeticiones sucesivas con una pipeta de vidrio pulida al fuego, obteniéndose una suspensión de células individuales. A continuación, se siembran neuronas simpáticas en placas recubiertas con colágeno ENC.Hola, soy Nila Zurin del laboratorio del Dr. Lloyd Green en el Departamento de Patología y Biología Celular de la Universidad de Columbia. Hoy demostraremos cómo aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de los ganglios cigomáticos superiores de crías rojas recién nacidas. En nuestro laboratorio, normalmente utilizamos estas células para estudiar la apoptosis en respuesta a la retirada del factor de crecimiento nervioso.Así que comencemos. Iniciamos el procedimiento recubriendo un plato de cultivo con colágeno de cola de rata 24 horas antes de realizar la disección. Dependiendo de la naturaleza del experimento, se utiliza una placa de cultivo de 24 o 48 pozos.A continuación se prepararán los medios y equipos de solución. Estos materiales y reactivos pueden encontrarse en el protocolo escrito que acompaña a este video. Es importante tener en cuenta que la solución de uridina y cinco FDU debe prepararse justo antes de su uso.Continúe la preparación con fuego. Pulido de las pipetas de pasteur de vidrio para los pasos de tación. La punta de la pipeta de vidrio se mantiene en la llama durante unos segundos mientras se gira para estrecharla y alisarla.El pulido inicial con llama debe realizarse en una cabina de cultivo celular estéril. Para comenzar la disección, recolecte crías de rata neonatal P cero a P uno. Una cría de rata neonatal se limpia rápidamente con etanol al 70 % para reducir la contaminación.Tras la decapitación, la cabeza se coloca sobre la almohadilla de disección con el lado ventral hacia arriba y el extremo del cuello orientado hacia usted. Debe ser fácilmente visible la tráquea seccionada. Se utilizan agujas estériles de jeringa para fijar la cabeza seccionada a la almohadilla de disección de la siguiente manera.Introduzca un alfiler a través del paladar hacia el soporte y coloque el segundo alfiler a través de la médula espinal seccionada hacia el soporte. Después de colocar la platina de disección bajo el microscopio y mirar a través de los oculares, utilice dos pares de pinzas para retirar la piel y la grasa alrededor de la tráquea. Teniendo cuidado de no profundizar demasiado, se expondrá un par de músculos que corren casi paralelos entre sí a ambos lados de la tráquea.Durante la disección, será necesario irrigar con PBS estéril frío o medio RPMI 1640 frío sin suero, administrado con una pipeta Pasteur estéril, para eliminar la sangre en exceso. Esto puede hacerse una vez o más de una vez, dependiendo de la velocidad del trabajo. Luego, se utilizan las pinzas para cortar y retirar el músculo primero de un lado.Una vez que se ha extraído el músculo, la arteria carótida quedará visible. Esta arteria discurre junto a la tráquea y se bifurca formando una estructura que parece una cinta con forma de Y. Esta bifurcación constituye un punto de referencia importante, y una vez localizada, será relativamente fácil encontrar los ganglios cervicales superiores.La arteria se secciona en el extremo más cercano y se levanta ligeramente con la pinza. El otro extremo de la arteria permanece unido. Una vez realizado esto, el ganglio cervical superior quedará visible.Se debe observar que tiene forma de almendra, aparece como una pequeña masa de tejido brillante unida laxamente a la arteria en el punto de bifurcación, y presenta conectores preganglionares y/o posganglionares similares a hilos. Se utiliza un segundo par de pinzas para separar suavemente el ganglio cervical superior y colocarlo en una pequeña placa de cultivo de 35 milímetros que contiene medio RPMI 1640 frío sin suero. A continuación, se extrae el ganglio del otro lado de la tráquea siguiendo el mismo protocolo.Una vez que todos los ganglios han sido disecados, se liberan lo más posible del tejido extraño. Al observar a través del microscopio, se puede notar que los ganglios tienen adheridos fragmentos de grasa de la arteria carótida u otros tejidos; se utilizan pinzas para separar estos materiales no deseados. También se recortan los conectivos pre y/o posganglionares.Cada ganglio tiene aproximadamente 10.000 neuronas. Una vez que las neuronas se siembran, regenerarán sus neuronas limpias. Luego, los ganglios se colocan en un tubo cónico estéril de polipropileno de 15 mililitros que contiene medio RPMI 1640.A continuación, se establece el cultivo de neuronas simpáticas. Los ganglios se centrifugan a 200 G durante dos minutos y se descarta el sobrenadante. Los ganglios se resuspenden en 0,5 a un mililitro de solución de tripsina al 0,25 % y luego se colocan en un baño de agua o incubadora a 37 grados Celsius durante 30 minutos para facilitar la disociación de las células en los ganglios.Después de 30 minutos, se añaden 10 mililitros de medio completo para diluir y neutralizar la tripsina. Las soluciones se centrifugan entonces a 200 ×g durante dos minutos. Se descarta el sobrenadante y los ganglios se resuspenden en dos mililitros de medio final.Utilizando una de las puntas de pipeta previamente preparadas y pulidas al fuego con una abertura ancha, las células se disocian aún más pasando los ganglios hacia arriba y hacia abajo 20 veces. Luego, el tubo se coloca sobre hielo durante unos minutos. A continuación, la punta de pipeta se pule nuevamente al fuego para hacer la abertura aún más estrecha.Después de que la pipeta se enfríe, los ganglios se trituran otras 20 veces. El medio se volverá progresivamente más turbio, lo que indica que las células se están disociando. Este paso se repite una o dos veces más, dependiendo de qué tan bien se disocien las células.Después de cierto tiempo, los ganglios se habrán disociado en neuronas y no serán visibles ganglios intactos en el tubo. Puede haber algo de material tisular que en este punto no se disocie. Se deja el tubo reposando en hielo durante unos minutos para que cualquier resto no asociado se sedimente en el fondo.Se recoge cuidadosamente todo el sobrenadante excepto aproximadamente 50 microlitros, que se coloca en otro tubo. Se dejan 50 microlitros en el fondo del tubo para evitar la transferencia de restos no asociados. Se añade más medio final al tubo que contiene las células disociadas.El volumen del medio final añadido depende del tipo de placa de cultivo que se utilice para cultivar las neuronas. Por ejemplo, si se va a emplear una placa de 24 pocillos, entonces siembre un ganglio por pocillo en 0.5 mililitros de medio final por pocillo.Una camada típica de ratas consta de 12 crías, lo que proporcionaría 24 ganglios. Esto es suficiente para sembrar una placa de 24 pocillos, y el volumen total del medio final es de 12 mililitros. El uso de uridina cinco FDU en el medio final evitará la proliferación y promoverá la muerte de una pequeña población de células gliales y otros tipos celulares.En el cultivo, las células se alimentan cada 48 horas reemplazando dos tercios del medio. Con RPMI fresco más 1 % de suero de caballo más NGF y uridina y cinco FDU. Al principio, el cultivo contiene neuronas simpáticas que se ven redondas sin neuronas.Las neuronas cortas se vuelven visibles 24 horas después de la disección y progresivamente se hacen más densas y ramificadas con el tiempo. Acabamos de mostrarle cómo aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de los ganglios cervicales superiores de ratones recién nacidos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar primero, tomarse el tiempo y tener cuidado al limpiar los ganglios, eliminando todos los restos, vasos sanguíneos y grasa.Este paso es importante para garantizar un cultivo más o menos homogéneo y libre de tipos celulares extraños. En segundo lugar, durante el paso de disociación, sea paciente y tómese el tiempo necesario para separar las neuronas de modo que no se encuentren en grandes agregados. Una vez que se asienten en las placas, los grandes agregados dificultarán el proceso.En aplicaciones posteriores, como la transección o la infección de las neuronas, la tinción inmunológica también podría verse dificultada, y cualquier experimento que requiera el conteo de neuronas será difícil de realizar. Por último, no es necesario suplementar el medio con penicilina-estreptomicina. Cada vez que se alimentan las cultivos, basta con añadir penicilina-estreptomicina únicamente la primera vez que se siembran las células.Agregue uridina cinco FDU fresca al medio cada vez que se cambie el medio. Nuestro laboratorio ha utilizado cultivos de neuronas simpáticas para estudiar la apoptosis en respuesta a la retirada del factor de crecimiento nervioso. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un protocolo para el uso de la proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o Matrigel para inducir de manera selectiva el crecimiento dendrítico en la enseñanza primaria neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de las ratas perinatales.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

El protocolo se describe un sistema modelo eficiente y reproducible para estudiar virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) latencia y reactivación. El ensayo emplea cultivos de neuronas simpáticas homogéneos y permite la disección molecular de las interacciones neurona-virus utilizando una variedad de herramientas incluyendo la interferencia de ARN y la expresión de proteínas recombinantes.

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Este video muestra un procedimiento para aislar neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de embriones de rata y co-cultivarlas con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann maduras. Los DRG aislados se procesan para aislar las neuronas y las células gliales. Las células aisladas se cultivan para purificar las neuronas, que luego se cultivan conjuntamente con células similares a las células de Schwann (SCLC) en un medio de cocultivo. La interacción con las neuronas...

Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

Este video describe el aislamiento y cultivo de células de Schwann de raíces espinales de ratón. A continuación, las células aisladas se cultivan en medios específicos. Las células de Schwann se aíslan mediante digestión diferencial y adherencia. Posteriormente se transfieren a cubreobjetos recubiertos de matriz extracelular para su fijación y proliferación.

Aislamiento de células de Schwann de raíces espinales de ratón

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de la columna vertebral de rata. Los GRD extirpados de la columna vertebral se tratan con enzimas y se disocian mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las células se cultivan en un medio que contiene inhibidores y factores de crecimiento que limitan la proliferación de células gliales y promueven el crecimiento neuronal, respectivamente.

Establecimiento de un cultivo primario de células de ganglios de raíz dorsal a partir de una columna vertebral de rata

Aquí se describe una célula de Schwann (CS) ensayo de migración en el que las SC son capaces de desarrollar a lo largo de los axones se extienden.

Analizar el desarrollo de células murinas Schwann largo de los axones en crecimiento

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Cultivos primarios de raíz dorsal (GRD) de los ganglios se utilizan con frecuencia para estudiar las funciones fisiológicas o eventos relacionados con patología en las neuronas sensoriales. Aquí, se demuestra el uso de culturas DRG lumbares para detectar la liberación de neurotransmisores después de receptor del neuropéptido FF tipo 2 estimulación con un agonista selectivo.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.

Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

Aislamiento y cultura de chick Ciliary Ganglion Neurons

El presente protocolo describe un modelo murino de ablación de inervación adrenérgica mediante la identificación y resección del ganglio cervical superior.

Técnica quirúrgica para la ganglionectomía cervical superior en un modelo murino

Aprende a aislar y cultivar neuronas simpáticas primarias de ganglios cervicales superiores de ratas recién nacidas. Este protocolo enzimático permite obtener cultivos viables para estudios de neurobiología y apoptosis.

Protocolo para las neuronas simpáticas de rata cultivo Ganglios cervical superior (SCG)

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