Name: Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Aprende a aislar y cultivar progenitores de neuronas granulares cerebelosas y neuronas de ratones posnatales usando disociación con papaina y gradiente de Percoll. Este método permite estudiar neurogénesis y diferenciación neuronal.

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Damos las gracias a Barbara Carletti y Anna Marie Kenney sugerencias invaluable. HYL el apoyo de la Formación Grant &quot;Hormonas: Bioquímica y Biología Molecular&quot;, DK07328. Apoyado en parte por el NIH subvención 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Configuración (1-2 días antes de la disección) (No se muestra el vídeo) <ol><li> PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CULTURA Y MEDIOS DE COMUNICACIÓN: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcio y magnesio libre de tampón fosfato salino-EDTA para las diluciones de Percoll) por litro, agregar 32 g de NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glucosa, 2 g de NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO stock 3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) a agua destilada / desionizada. Ajuste el volumen a 1 litro y el pH a 7,4. Filtro de esterilización. </li><li> HBSS-glucosa: glucosa Añadir (6 gramos / litro) de calcio y magnesio Solución libre salina equilibrada de Hank (HBSS) y un filtro estéril. 500 ml se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> MEDIOS DE CULTIVO: medio libre de suero (SFM) y el 10% medio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Media añadir 500 l 100X Glutamax I, 500 l 100X penicilina-estreptomicina (final de 100 unidades de penicilina y estreptomicina 100 mg), 6,25 l 2 M KCl (final de 250 mM). Dividida en 2 partes alícuotas de 9 ml y 40 ml. Para preparar el 10% medio FBS, añadir 1 ml de SFB inactivado por calor a la parte alícuota de 9 ml. Para preparar la ordenación forestal sostenible, añadir 800 l de los suplementos de suero libre de B-27 a la alícuota de 40 ml. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C por un máximo de 2 semanas. Para obtener mejores resultados que los medios de comunicación nuevos para cada experimento. </li></ul></li><li> Preparar las diluciones de Percoll: <ul><li> Percoll se presenta como un líquido y debe ser acidificada antes de su uso. Para preparar el caldo, agregar HCl 1N, poco a poco a la solución de Percoll durante un período de 1-2 horas hasta pH 7,4 se alcanza. Añadir el HCl demasiado rápido hará que el Percoll al conjunto. Aproximadamente 6.5ml de HCl 1 N se necesitan por cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li><li> Un 35% y un 60% (vol: vol) de dilución Percoll se utilizará en el paso gradiente de Percoll. Preparar 100 ml de Percoll diluciones que contiene 35 o 60 ml de Percoll de valores, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA y agua destilada / desionizada H2O para el volumen final. Añadir unas gotas de azul de toluidina para la solución del 60%, sino que le ayudará a visualizar la interfaz y las células. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA no deben ser mayores de 3 meses, como búfer insuficiente causará la muerte celular aumentó durante el procedimiento. </li></ul></li><li> Cubreobjetos PREPARACIÓN: cubreobjetos de cristal (mejor si es de Carolina Biological Supply Company) se lavan con HCl 10% durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave, enjuagar con agua destilada / deonized agua y almacenados en etanol al 70%. Antes de usar, solo se llama cubreobjetos esterilizados por brevemente la celebración con unas pinzas sobre una llama abierta (mechero Bunsen) hasta que se evapore el etanol. 12 mm cubreobjetos de vidrio se pueden colocar en placas de cultivo de 4 bien y cubreobjetos de 25 mm en placas de cultivo de 6 pocillos. </li><li> BUQUES DE LA CULTURA DE RECUBRIMIENTO CON SOPORTE: Para la tinción de inmunofluorescencia o tratamientos farmacológicos cubreobjetos de vidrio son más adecuados, ya que pueden ser fácilmente montados en portaobjetos de vidrio para la visualización en el microscopio. Cuando un gran número de células necesarias para la recogida de muestras de ARN o de proteína, las células pueden ser cultivadas en la cultura de plástico dishes.The noche antes de la disección, cubreobjetos de vidrio o platos de plástico para la cultura deben ser recubiertas con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 l / pocillo para placas de 6 pocillos o 350 l / pocillo de 4 placas). 5 mg / ml de solución stock de poli-D-lisina se almacena a -20 ° C, después se diluyó en agua destilada estéril / deonized el agua y el derecho de filtrado estéril antes de su uso. Recipientes de cultivo se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la chapa) y se lavó dos veces con el derecho de agua destilada estéril / deonized de las placas,. </li><li> La preparación de platos PREPLATING: Estos platos serán utilizados para pre-revestimiento de las células del cerebelo aislado antes del cultivo para eliminar los contaminantes gliales, que se adhieren más fácilmente a una menor concentración de sustrato. Dos capas de 60 mm placas de cultivo de plástico con 4 ml por placa de poli-D-lisina (100 ug / ml; Nota: esta es 1 / 5 de la concentración utilizada para el cultivo). Se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la disección). Justo antes de la disección, se retira la solución de poli-D-lisina, lavar los platos dos veces con agua estéril y dejar secar en la campana. </li><li> Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos. Herramientas necesarias: unas tijeras Permaset, tijeras microdissecting, cuatro Dumont # 5 pinza de disección. </li></ol> Parte 2: Preparación para la disección (día de la disección) - (demostrada en el vídeo) Todos los procedimientos siguientes se realizan en una campana de cultivo de tejidos a menos que se. <ol><li> Limpie el área de disección con etanol al 70%. Caliente los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua o en un 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Cuando se inicia un nuevo sistema de papaína disociación Kit (Worthington), preparar la solución de albúmina ovomucoide inhibidor. Agregar 32 mlde EBSS (solución salina balanceada de Earle, en el kit) a la mezcla de inhibidor de la albúmina ovomucoide y permitir que los contenidos se disuelven, mientras que la preparación de los otros componentes. Reconstituir en la primera utilización, guarde la solución restante a 2-8 º C y utilizar hasta los cinco aislamientos permitido por cada kit se han completado. </li><li> Añadir 5 ml de EBSS al vial de la papaína uno de los kit de disociación (cada vial es suficiente para la disociación de 4 a 15 cerebelo de postnatal día 5 ratones). Coloque el vial de la papaína en un 5% de CO 2 37 ° C o incubador de 37 ° C baño de agua durante 5 a 10 minutos hasta que la papaína se disuelva por completo y la solución parece clara. Mantener la solución a temperatura ambiente durante la disección. </li><li> Añadir 500 l de EBSS a un vial DNasa del kit de disociación. Mezclar suavemente tocando el vial desde DNasa es sensible a la desnaturalización de corte. Añadir 250 l de esta solución en el vial que contiene la papaína (concentración final es de 20 unidades / ml papaína y el 0,005% DNasa). Guarde el resto de vial DNasa para su uso en el paso 5.1 o 6.1. </li></ol> Parte 3: Disección y eliminación de las meninges <ol><li> La edad óptima para el cultivo de células granulares de ratones C57BL/6J es después del día 06/04, cuando el número de células progenitoras de células granulares de la EGL peaks1, 10. Diseccionar las crías de una en una, y como que se familiarice más con la disección del cerebelo tratar de reducir el tiempo de la disección a no más de 6 minutos por cada cachorro. La velocidad es la esencia. Si el paso se pasa por alto gradiente de Percoll, ocho días después del parto-5 crías de ratón puede producir suficientes células de una placa de cultivo de 6 pocillos (o seis de 25 mm cubreobjetos) o por seis placas de cultivo de 4 bien (o veinticuatro 12 - mm cubreobjetos). Rendimiento aproximado es de 4 a 5x106 células por la densidad de cría y de las planchas puede variar entre 1 y 5x105 células/cm2. Dado que las células del 15-20% se pierden durante el Paso 4 Percoll, más animales se necesitan para obtener la misma densidad deseada de la célula. </li><li> Pipeta de 15 ml de HBSS-glucosa en un 60 mm plato de plástico de cultivo de tejidos y de 10 ml en una estéril Falcon 15 ml tubo de plástico cónico. Poner en hielo. </li><li> Fuera de la campana, limpie la cabeza del cachorro con el 70% de etanol. Use las tijeras Permaset para decapitar al cachorro. (La decapitación no será mostrado en el video.) </li><li> En la capilla, sostener la cabeza con unas pinzas Dumont de modo que usted puede ver claramente la parte posterior del cráneo. El acceso al cerebro mediante la inserción de tijeras microdissecting dentro del foramen magno y el corte en línea recta hacia los ojos. Con unas pinzas, retire la piel y levantar el cráneo para exponer el cerebro. El uso de pinzas Dumont, pellizcar el cerebelo y el mesencéfalo rodea y su transferencia a la fuente con HBSS-glucosa. (Es más fácil de manipular el cerebelo y eliminar las meninges si el cerebelo está todavía en el tejido circundante). </li><li> Bajo el microscopio de disección, suavemente pelar las meninges de la cerebelo y también entre los lóbulos con una multa Dumont # 5 fórceps durante el uso de las pinzas de anclaje a otros por el cerebelo a la placa. Usted se dará cuenta de los vasos sanguíneos en la superficie del cerebelo. Estos vasos sanguíneos son una buena manera de identificar las meninges. Quite la meninges hasta el cerebelo tiene un aspecto blanco mate. Separar el cerebelo desde el resto del cerebro medio. A su vez a su lado ventral y eliminar el plexo coroideo, que se parece a una cinta de color rojizo entre el cerebelo y el mesencéfalo ventral adyacente. Coloque cada cerebelo en frío HBSS-glucosa en un tubo cónico de 15 ml en hielo tan pronto como disecados. Cambie la solución de disección a un nuevo HBSS-glucosa después de la disección de tres cerebros. </li></ol> Parte 4: Suspensión celular <ol><li> Una vez que todas las disecciones se termine, quite el HBSS-glucosa desde el tubo y reemplazarlo con la solución de papaína en el paso 2.4. Aunque el equipo recomienda cortar el tejido en trozos pequeños, nos encontramos con que no es necesario cortar o picar el cerebelo a esta edad. Coloque el tejido + solución de papaína (en un tubo cónico de 15 ml) en un 37 ° C baño de agua o 5% de CO 2 37 ° C incubadora durante 15 a 20 minutos. De 4 a 8 cerebelo, a 15 minutos a 37 º C es suficiente para un mayor número de cerebelo 20 a 30 minutos es mejor. Agite suavemente el tubo cada 3 a 4 minutos. </li><li> Triturar la mezcla con una punta de la pipeta estéril p1000 aerosol que ha sido recubierto con FBS. Hacer este paso con cuidado para evitar que la formación de burbujas de aire. Pipetas de vidrio pulido de incendios se puede utilizar, pero nos encontramos con que el suero estéril recubierta p1000 consejos aerosol funcionan igual de bien. Para cubrir la punta de la pipeta con el FBS, FBS pipeta hacia arriba y abajo dos veces antes de usar. Alrededor de 10 movimientos arriba y abajo con la pipeta son suficientes para disociar el tejido. La solución se enturbie. Permitir la suspensión de sentarse por 30-60 segundos para que los trozos grandes de tejido no disociado se asentará en el fondo del tubo. </li><li> Eliminar las células en suspensión (cuidado de no quitar las piezas de tejido no disociado en el bottom) en un nuevo tubo de 15 ml cónicos con una pipeta de punta recubierta de suero. Se centrifuga a aproximadamente 200xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Prepare la resuspensión medio. Para ello, mezcla de 2,7 ml EBSS con 300 l de solución reconstituida inhibidor de la albúmina ovomucoide en un tubo estéril. Añadir 150 ml de solución de DNasa en el paso 2.4. </li><li> Después de centrifugar, descartar el sobrenadante e inmediatamente resuspender el botón celular en los gases de DNasa / inhibidor de la solución de albúmina preparada en la etapa 4.3 con un suero recubierto p1000 aerosol punta de la pipeta. </li><li> Preparar un gradiente de densidad discontinuo de la siguiente manera. Añadir 5 ml de solución de inhibidor de la albúmina ovomucoide a un tubo cónico de 15 ml. Cuidadosamente la capa de células en suspensión en la parte superior. Se centrifuga a aproximadamente 70xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Disociada precipitar las células en la parte inferior del tubo, fragmentos de membrana permanecen en la interfaz. </li><li> Si desea obtener cultivos que se enriquecen en las células granulares, evitar el gradiente de Percoll paso de separación (que produce cultivos puros de células granulares del cerebelo), y proceder a la parte 6. Si desea aislar aún más a las células granulares de la glía y las interneuronas grandes por la separación de gradiente de Percoll, proceder a la parte 5. El uso del paso gradiente de Percoll reduzca el rendimiento de las células. En nuestras manos, la reducción en el rendimiento es de aproximadamente 20-35%. Sin embargo, hay un aumento en el enriquecimiento de las neuronas granulares y las células progenitoras de aproximadamente el 90% al 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separación gradiente de Percoll <ol><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 2 ml de HBSS-glucosa con 50 l de DNasa de paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple. </li><li> Prepare dos pulido fuego de vidrio pipetas Pasteur. Para ello, llama suavemente la punta de una pipeta de vidrio hasta que el borde se suaviza y el agujero pipeta es de 40-50% del tamaño original. Tenga cuidado de no hacer que la abertura muy pequeña. </li><li> Prepare gradiente de Percoll. Colocar 10 ml de solución de Percoll al 35% en un tubo cónico de 50 ml estéril. 60% de Percoll (10 ml) se carga en una jeringa de 10 ml estéril con una aguja estéril adjunta la columna vertebral. Suavemente la capa de Percoll al 60% por debajo de la solución de solución al 35%, mediante la adición de la solución al 60% en la parte inferior del tubo con la aguja espinal. Tenga cuidado de mantener una interfaz clara entre las dos capas. Añadir a las células a la parte superior de la pendiente con una pipeta pulida al fuego, añadir suavemente a lo largo del lado del tubo sin molestar a la interfaz. </li><li> Con cuidado, coloque el tubo de la centrífuga y centrifugar a 1800xg. Rampa hasta la velocidad de un paso cada 20 segundos (incrementos de velocidad son los siguientes: de aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) de modo que dura aproximadamente 2 minutos para alcanzar la velocidad deseada. Iniciar el temporizador de 10 minutos, cuando se alcanza 1800xg. Cuando haya terminado, disminuir la velocidad poco a poco a un paso cada 20 segundos. </li><li> Eliminar la interfaz superior de la pendiente (que contiene las células de grandes, las células de Purkinje y las interneuronas) y descarte. </li><li> Retire con cuidado las células en la interfase entre el 35% y el 60% de Percoll con una pipeta pulida al fuego y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. Resuspender en 3 volúmenes de HBSS-glucosa y mezclar invirtiendo varias veces. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa. Resuspender el precipitado con cuidado usando una pipeta pulida al fuego para formar una suspensión de células individuales. Continúe con el paso 6.2. </li></ol> Parte 6: Pre-placas y Revestimiento <ol><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa en el paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple. </li><li> Placa de las células recogidas en un poli-D-lisina recubierto pre-revestimiento plato durante 20 minutos en un 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Repita el procedimiento con un plato dulce. Las células astroglía y más pesado se calmará y se adhieren a los platos y dejar a las neuronas granulares pequeñas y células neuronales progenitoras flotante. Después de la incubación, libremente adheridas las neuronas granulares y las células progenitoras neuronales son desalojados fácilmente y afloja con suaves golpecitos de la placa. </li><li> Recoger las neuronas granulares y las células progenitoras de neuronas en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200xg durante 5 minutos. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio libre de suero y el recuento de una alícuota de 10 l con un hemocitómetro. </li><li> Añadir medio libre de suero para llegar a la densidad celular deseada. Las guías para el número de células a la placa de media densidad: de placas de 6 pocillos, 3,5 a 4 millones de células, de las placas de 4 pocillos, 650.000 células. De 6 y placas de cultivo, que la placa de 1,5 ml / pocillo y 4, así pla-tes, que la placa de 0,5 ml / pocillo. Las células se mantienen en un 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Cambiar el medio por completo 24 horas más tarde con los cambios subsiguientes se celebrarán cada dos o tres días. </li></ol>

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</ol>

Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 3,7,11. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación. Las neuronas granulares y las células progenitoras se adhieren a las 2 horas de la siembra. Las células sanas tienen una morfología redonda bajo el 4 microscopio de contraste. Dentro de 24 horas después de la siembra, las células sanas se distribuye uniformemente en todo el cubreobjetos o el plástico y así se forma los procesos. En...

<table><tbody><tr><td>Filtro celular con malla de poro de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Aguja espinal</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 pulgadas</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina, peso molecular&amp;gt;300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Debe probarse cada nuevo lote de poli-D-lisina.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Debe estar libre de calcio y magnesio.</td></tr><tr><td>Medio Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento libre de suero B-27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares de 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Estos se fabrican en Alemania por Deckglaser.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares de 25 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Estos se fabrican en Alemania por Deckglaser.</td></tr><tr><td>Sistema de disociación con papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>El kit sirve para cinco aislamientos.</td></tr><tr><td>Tijeras Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont n.º 5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 4 pocillos</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de post-natal células de ratón cerebelosa gránulo progenitor neuronas y las neuronas

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

La corteza del cerebelo es una estructura bien descrito que ofrece oportunidades únicas para el estudio de las propiedades neuronales y 1,2 de desarrollo. De los tipos neuronales del cerebelo (células granulosas, células de Purkinje y las interneuronas inhibitorias), las neuronas granulares son con mucho los más numerosos y son el tipo más abundante de las neuronas en el cerebro de los mamíferos. En roedores, las neuronas del cerebelo gránulo se generan durante las dos primeras semanas después del parto a partir de células progenitoras en la capa más externa de la corteza cerebelosa, la capa granular externa (EGL). El protocolo que aquí se presenta describe las técnicas para enriquecer la cultura y las neuronas granulares y sus células progenitoras de cerebelo de ratón post-natal. Vamos a describir los procedimientos para obtener cultivos de pureza cada vez mayor de 3,4, lo que puede ser usado para estudiar la diferenciación de la proliferación de células progenitoras en 5,6 neuronas granulares. Una vez que las células progenitoras se diferencian, las culturas también proporcionan una población homogénea de las neuronas granulares para la manipulación experimental y caracterización de fenómenos como la sinaptogénesis, la función del receptor de glutamato 7, la interacción con otras células del cerebelo 8,9 purificada o muerte celular 7.

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

La corteza cerebelosa es una estructura bien descrita que ofrece oportunidades únicas para estudiar el desarrollo y las propiedades neuronales1,2. De los...

Este procedimiento comienza con la extracción del cerebelo de P cuatro a P cinco. Se eliminan las meninges y el plexo coroideo de los cerebelos individuales de ratones recién nacidos, los cuales luego se recogen en un tubo cónico de 15 mililitros. Los cerebelos se disocian con papaína y se obtiene una suspensión individual de células mediante agitación suave.Esta suspensión se filtra por gravedad a través de una malla de nailon con un tamaño de poro de 70 micrones. El flujo que atraviesa se superpone suavemente sobre un gradiente discontinuo de percoll y se centrifuga para separar las células granulares de la glía en neuronas y neuronas con genes Perkin. Las celdas en la interfase del gradiente se recolectan y se precultivan en placas recubiertas con poli-l-lisina.Para eliminar aún más las células gliales, se recolectan, cuentan y siembran las células granulares en densidades deseadas sobre laminillas de vidrio recubiertas con poli-l-lisina o placas de cultivo de plástico. Hola, soy Hey Young Lee del laboratorio del Dr. Lloyd Green en el Departamento de Patología de la Universidad de Columbia. Hoy les mostraré un procedimiento para aislar y cultivar neuronas granulares cerebelosas de ratones posnatales.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la proliferación y diferenciación de progenitores neuronales de células granulares. Así que comencemos. Este procedimiento comienza con el uso de etanol al 70 % en el área de disección para disociar células granulares del cerebelo; utilizamos el sistema de disociación de Papain.Al comenzar un nuevo kit, prepare la solución inhibidora de albúmina OVO equate MOID. Para ello, tome 32 mililitros de solución salina equilibrada de Earle o EBSS, que se proporciona en el kit, y añádala a la mezcla de albúmina OVO moid. Déjela aparte mientras prepara los otros componentes para permitir que los contenidos se disuelvan.A continuación, agregue cinco mililitros de EBSS a un vial de papaína del kit de disociación. Cada vial es suficiente para disociar de cuatro a 15 cerebelos de ratones P5. Luego, coloque el vial de papaína en un incubador con 5 % de CO₂ a 37 °C durante cinco a diez minutos, hasta que la papaína se disuelva completamente y la solución aparezca clara.Mantenga la solución a temperatura ambiente durante la disección. A continuación, agregue 500 microlitros de EBSS al vial 1D NAS del kit. Mezcle suavemente golpeando el vial.Dado que el DNAS es sensible a la desnaturalización por cizalladura, agregue 250 microlitros de esta solución al vial de pepane para obtener una concentración final de 20 unidades por mil y 0,005% de DNA; guarde el archivo de DNA restante para su uso en pasos posteriores. Una vez que las herramientas y los reactivos estén listos, proceda a diseccionar los cerebelos y a eliminar las meninges para este procedimiento. Se utilizan ratones C57 negro seis entre los días cuatro y seis posteriores al nacimiento.Este rango de edad es óptimo para el cultivo de células granulares porque el número de progenitores de células granulares de la capa granular externa o EGL es máximo. Comience pipeteando 15 mililitros de HBSS con glucosa en un recipiente plástico de cultivo de tejidos de 60 milímetros y 10 mililitros en un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Coloque el tubo en hielo, limpie la cabeza del cachorro con etanol al 70 %. Use tijeras de disección para retirar la cabeza.Transfiera la cabeza a la cabina y sosténgala con pinzas de modo que la parte posterior del cráneo sea claramente visible. Inserte las tijeras de disección microscópica en el foramen magno para acceder al cerebro y luego corte en línea recta hacia los ojos. Utilice pinzas finas Dumont.Paso cinco, usar la pinza para retirar la piel y levantar el cráneo a fin de exponer el cerebro. Luego, seccionar el cerebelo y la porción circundante del mesencéfalo. Transferirlo al recipiente que contiene HBSS con glucosa.Téngase en cuenta que es más fácil manipular el cerebelo y eliminar las meninges si este aún está unido al tejido circundante. A continuación, coloque el tejido bajo un microscopio de disección. Luego, use un par de pinzas para fijar el cerebelo sobre la placa.Utilice pinzas finas Dumont número cinco para pelar suavemente las meninges del cerebelo, así como entre los lóbulos. Observará vasos sanguíneos en la superficie del cerebelo.Estos vasos sanguíneos son una buena manera de identificar las meninges. Continúe eliminando las meninges hasta que el cerebelo adquiera un aspecto blanco mate. Luego, separe el cerebelo del resto del mesencéfalo.Colóquelo sobre su lado ventral y retire el plexo coroideo, que tiene el aspecto de una cinta rojiza entre el cerebelo ventral y el mesencéfalo adyacente. Tan pronto como se seccione el cerebelo, colóquelo en HBSS con glucosa frío en un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Después de seccionar tres cerebros, reemplace la solución de disección con HBSS con glucosa fresca.A medida que vaya adquiriendo mayor familiaridad con la disección cerebelosa, intente reducir el tiempo de disección a no más de seis minutos por cría. Cuando las disecciones estén completas, continúe con la preparación de la suspensión celular. Paso para generar una suspensión celular a partir de las disecciones cerebelosas.Primero, retire el HBSS con glucosa del tubo y sustitúyalo por la solución de papaína. Aunque el kit recomienda cortar el tejido en trozos pequeños, consideramos que no es necesario a esta edad. Incube el tejido con la solución de papaína en un incubador con 5 % de CO₂ a 37 grados durante 15 a 20 minutos.Para cuatro u ocho cerebelos, incubar durante 15 minutos. Para un número mayor, incubar hasta media hora. Agitar suavemente el tubo cada tres o cuatro minutos.Una vez finalizada la incubación, comience el paso de rotación: recubra una punta estéril de pipeta aerosol P 1000 con FBS aspirando y expulsando dos veces. Ahora agite la mezcla. Asegúrese de pipetear suavemente para evitar la formación de burbujas de aire.Aproximadamente de 10 movimientos hacia arriba y hacia abajo con la pipeta son suficientes para disociar el tejido. La solución debe volverse turbia. Deje reposar la suspensión durante 30 a 60 segundos para que cualquier trozo grande de tejido no disociado se sedimente en el fondo del tubo.Aunque se pueden usar pipetas de vidrio pulidas con llama para la transferencia, hemos encontrado que puntas estériles recubiertas con suero para P1000 funcionan igual de bien. A continuación, retire las células en suspensión y colóquelas en un tubo cónico nuevo de 15 ml utilizando una punta de pipeta recubierta con suero, teniendo cuidado de no retirar los fragmentos de tejido no asociados que se encuentran en el fondo. Luego, centrifugue la suspensión celular a aproximadamente 200 ×g durante cinco minutos.A temperatura ambiente durante la centrifugación, prepare el medio de suspensión de resuspensión. Para ello, agregue 2,7 mililitros de EBSS en un tubo estéril. Luego, agregue 300 microlitros de la solución reconstituida del inhibidor de albúmina OVO MOID.Finalmente, agregue 150 microlitros de la solución de ADN. Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda inmediatamente el botón celular en la solución diluida de albúmina inhibidora de ADN. Nuevamente, utilice una punta de pipeta recubierta con suero para resuspender el botón.Ahora prepare un gradiente de densidad discontinuo. Para hacerlo, agregue cinco mililitros de la solución de albúmina con inhibidor MOID oval a un tubo cónico de 15 mililitros. Añada suavemente la suspensión celular sobre la solución vertiendo las células por el costado del tubo, luego centrifugue a aproximadamente 70 G durante seis minutos.A temperatura ambiente, las células disociadas se sedimentarán en el fondo del tubo mientras que los fragmentos de membrana permanecerán en la interfase. Si desea obtener cultivos enriquecidos en células granulosas, no es necesario realizar una purificación adicional. Deseche el sobrenadante SUP y resuspenda inmediatamente el sedimento en cuatro mililitros de medio con 10% FBS y 50 microlitros de DNAs.Filtre esta suspensión por gravedad a través de una malla de nylon con un tamaño de poro de 70 micrones. Este paso elimina las células no neuronales grandes y proporciona una mejor suspensión de células individuales. A continuación, omita el siguiente paso de separación por gradiente por columna y continúe con el paso de siembra celular.O si desea purificar aún más las células granulosas a partir de la glía y las grandes interneuronas, continúe con el gradiente Percoll. Paso: descarte el sobrenadante e inmediatamente resuspenda el sedimento en dos mililitros de HBSS con glucosa y 50 microlitros de ADNasa.De nuevo, filtre la suspensión a través de una malla de níquel antes de comenzar la separación en gradiente de Percoll. Prepare dos pipetas Pasteur con la punta pulida con llama. Caliente suavemente la punta de una pipeta hasta que el borde quede liso y el orificio tenga aproximadamente la mitad del tamaño original. Tenga cuidado de no hacer la abertura demasiado pequeña.Ahora prepare el gradiente de Percoll. Coloque 10 ml de solución de Percoll al 35 % en un tubo cónico estéril de 50 ml. Luego cargue 10 ml de Percoll al 60 % en una jeringa estéril de 10 ml con una aguja espinal estéril acoplada.Coloque suavemente la solución al 60 % por encima de la solución al 35 % dejando que la punta de la jeringa toque el fondo del tubo. Tenga cuidado de mantener una interfase nítida entre las dos capas. A continuación, agregue las células en la parte superior del gradiente.Utilizando una pipeta pulida con fuego, agregue suavemente las células a lo largo del costado del tubo sin perturbar la interfase. Después de colocar cuidadosamente las células en capas, coloque el tubo en la centrífuga. Comience la centrifugación a aproximadamente 18 G. Aumente la velocidad un paso cada 20 segundos, de modo que tarde aproximadamente dos minutos en alcanzar 1800 G. Después de 10 minutos a 1800 G, disminuya gradualmente la velocidad un paso cada 20 segundos.Una vez finalizada la centrifugación, retire la interfase superior del gradiente y deséchela. Esta interfase contiene grandes células ggl bikini y neuronas intermedias. A continuación, use una pipeta flameada para retirar cuidadosamente las células presentes en la interfase.Transfiera las células a un tubo de 50 ml. Si el volumen llega a ser mayor de 15 ml, divídalos en dos tubos de 50 ml y resuspenda en tres volúmenes de glucosa HB S'S y mezcle invirtiendo varias veces. Luego, centrifugue durante cinco minutos a 1100 ×g. Ahora retire el sobrenadante y agregue cuatro ml de medio que contenga 10 % de FBS y 50 microlitros de D ns reus.Suspenda suavemente el sedimento utilizando una pipeta pulida con llama para obtener una suspensión simple de células. Una vez que las células estén resuspendidas, continúe con el prepl. Las células prelantan las células recolectadas en una placa recubierta con poli-lisina durante 20 minutos.En un incubador a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Durante la incubación, las astroglias y las células más pesadas se asentarán y adherirán a las placas, mientras que las neuronas granulares pequeñas y las células progenitoras neuronales permanecerán flotando o débilmente adheridas. Después de 20 minutos, golpee suavemente la placa para desprender las células granulares débilmente adheridas.Luego, transfiera la suspensión celular a una placa nueva recubierta con poli-D-lisina y repita la incubación. A continuación, recoja las neuronas granulares y las células progenitoras neuronales en un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 200 ×g durante cinco minutos. Luego, resuspenda el sedimento en 1 ml de medio libre de C y cuente utilizando un hemocitómetro.Finalmente, añada medio sin suero para alcanzar la densidad celular deseada y sembrar a densidad media. Para placas de seis pocillos, utilice aproximadamente entre tres millones y medio y cuatro millones de células para placas de cuatro pocillos.Utilice 650,000 células. Mantenga las células en un incubador a 37 grados con 5% CO2. Cambie completamente el medio 24 horas después del siembra inicial, y luego cada dos o tres días a partir de entonces.A continuación se muestran algunas imágenes de cultivos sanos de neuronas granulares y células progenitoras. Veinticuatro horas después de la siembra y seis días después de la siembra. Estas células pueden mantenerse en cultivo hasta dos semanas.Téngase en cuenta que dentro de las 24 horas posteriores al sembrado, las células sanas se extenderán uniformemente alrededor de las laminillas o del pocillo de plástico y emitirán prolongaciones. La agregación celular y la presencia de varicosidades en las prolongaciones indican que las células están enfermas o que el sustrato de polilisina es tóxico. Como se observa en el diagrama, los precursores de neuronas granulares comienzan a diferenciarse tras el sembrado y expresan marcadores.Representativo de su diferenciación. La proliferación de precursores de neuronas granulares puede prolongarse sustancialmente mediante la adición de hedgehog sónico al medio. También se puede añadir laminina como sustrato, además de polilisina, para promover el crecimiento de neuritas.Estas características del cultivo de células granulares ofrecen un sistema para estudiar bien la biología de las neuronas granulares, bien la regulación de la diferenciación de células progenitoras en neuronas. Acabamos de mostrarle cómo aislary cultivar progenitores neuronales y neuronas granulares cerebelosas MAO. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el rendimiento aproximado es de 4 a 5 × 10¹⁰.De las seis células por cría, las densidades de siembra pueden variar entre cinco veces la cantidad central de células por centímetro cuadrado. Así, si se omite el paso del gradiente de percoll, ocho crías de ratón de cinco días posnatales pueden producir suficientes células para seis placas de cultivo de cuatro pocillos; en mi experiencia, la utilización del paso del gradiente de percoll reducirá el rendimiento celular aproximadamente en un 25 %. Sin embargo, el porcentaje de neuronas granulares en los cultivos aumenta del 90-95 % al 99 %. Las células granulares enriquecidas obtenidas sin el paso de separación por gradiente de percoll se han utilizado para estudiar la regulación de la proliferación y diferenciación de progenitores de neuronas granulares. No obstante, si los cultivos van a utilizarse más allá de varios días in vitro, se recomienda incluir el paso del gradiente de percoll con el fin de disminuir la contaminación de las neuronas granulares por células no neuronales en proliferación.Además, asegúrese de que las soluciones utilizadas para preparar el gradiente por cot sean frescas, ya que una amortiguación inadecuada conduce a una mayor muerte celular. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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