Analyse de l’enzyme d’isolement et de restriction de l’ADN

1. Expand
   • NOTE : Dans cette expérience, vous allez effectuer une isolation de l’ADN dans deux conditions expérimentales : l’une en utilisant un tampon contenant la FDS de détergent et l’autre sans détergent. Hypothèses : L’autre hypothèse pour cette expérience pourrait être que l’échantillon préparé sans SDS, un détergent anionique puissant qui brise les membranes cellulaires, produira moins d’ADN que l’échantillon préparé avec SDS. L’hypothèse nulle de cette expérience pourrait être que les deux échantillons produiront une quantité égale d’ADN.
   • Pour commencer à prélever un échantillon de tissu pour l’isolement de l’ADN. Ici, vous utiliserez vos propres cellules de joue. Utilisez un bâtonnet de popsicle pour gratter l’intérieur de vos joues pendant environ 30 s. IMPORTANT : Ne grattez pas assez fort pour causer de la douleur ou faire couler du sang.
   • Positionnez un entonnoir dans un tube conique de 15 ml.
   • Ensuite, prenez 10 ml de la solution saline à 1 % qui vous a été fournie dans une tasse étiquetée et faites-la tourner dans votre bouche sans l’avaler.
   • Continuez à agiter pendant 90 s, puis crachez la solution saline contenant les cellules de votre joue dans l’entonnoir pour la recueillir dans le tube conique.
   • Ensuite, étiquetez deux tubes de microcentrifugation vides avec vos initiales.
   • Étiquetez l’un des tubes comme +SDS et l’autre comme -SDS pour différencier les deux traitements.
   • Ajoutez ensuite 1,5 à 2 ml de la solution saline contenant les cellules de la joue dans chaque tube.
   • Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse pendant 30 s.
   • Retirez les tubes de la microcentrifugeuse et versez soigneusement le surnageant sans déranger les cellules collectées au fond de chaque tube.
   • Remplissez les tubes avec plus de solution saline contenant les cellules de la joue et répétez la centrifugation.
   • Répétez ce processus en prenant soin de répartir uniformément les cellules entre les tubes +SDS et -SDS jusqu’à ce que toutes les cellules de la joue aient été collectées.
   • Ensuite, ajoutez 1 mL de tampon de lyse contenant des FDS dans le tube marqué +SDS, puis remettez en suspension la pastille de cellule en le pipetant de haut en bas.
   • Ajoutez ensuite 1 mL de tampon de lyse sans SDS dans le tube marqué d’un -SDS et remettez en suspension la pastille de cellule en le pipetant de haut en bas.
   • Après cela, ajoutez 10 μL de protéinase K dans chaque tube, puis placez soigneusement les tubes dans le bain-marie à 56 ºC pendant 10 min.
   • Après 10 minutes, retirez soigneusement les tubes du bain-marie et ajoutez 100 μL de 2,5 M de NaCl dans chaque tube.
   • Fermez fermement les tubes et retournez-les plusieurs fois pour mélanger.
   • Ensuite, étiquetez un tube conique de 15 mL comme +SDS et un autre avec -SDS.
   • Versez le contenu de chaque tube de microcentrifugation dans le tube conique de 15 mL correspondant.
   • Obtenez une aliquote de 10 ml d’éthanol à 100 % du congélateur.
   • Tenez l’un des tubes coniques en biais et versez lentement 1 mL d’éthanol à 100 % dans le tube pour former une couche sur le liquide déjà dans le tube.
   • Répétez ce processus pour le deuxième tube conique.
   • Regardez maintenant vos deux tubes. Il doit y avoir un précipité filandreux présent à l’interface de l’éthanol et de la couche aqueuse située en dessous. Ce matériau filandreux contient l’ADN isolé. Prenez des photos de l’ADN dans le tube et faites des notes descriptives claires et des dessins de vos observations dans votre carnet.
   • À l’aide d’un agitateur en verre, prélevez l’ADN du tube +SDS et examinez-le. Répétez cette opération pour le tube -SDS, en enregistrant à nouveau vos observations. Notez si l’un des tubes semble avoir plus de précipité que l’autre, et pourquoi cela pourrait être.
   • Enfin, jetez tous les déchets liquides dans le conteneur à déchets approprié et remettez tous les outils à leur emplacement approprié dans le laboratoire.
2. Enzyme de restriction Digestion virtuelle Expand
   • Pour étudier le fonctionnement des enzymes de restriction, rendez-vous d’abord sur le site Web de New England Biolabs : https://www.neb.com/
   • Les ressources disponibles sur ce site permettent aux chercheurs de réaliser des expériences virtuelles avant qu’elles ne soient réalisées en laboratoire. Cliquez sur « Outils et ressources » pour trouver l’outil NEBcutter et ouvrir le programme.
   • À droite du champ de recherche, trouvez la liste qui dit « Viral + phage ». Dans cette liste, sélectionnez Lambda. C’est le nom de l’ADN que vous allez digérer. Sélectionnez l’option Linéaire où l’outil indique « la séquence est » et l’option « Enzymes NEB » où l’outil indique « Enzymes à utiliser ». Cliquez ensuite sur Envoyer.
   • La page suivante affichera une carte de restriction complète de l’ADN lambda. Cette carte de restriction peut être utilisée pour prédire ce qui se passera si certaines enzymes sont utilisées. Ensuite, cliquez sur « Résumé personnalisé » sous la rubrique « Options principales ».
   • Recherchez l’enzyme StuI et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon CS. Sélectionnez l’enzyme StuI et cliquez sur Digest.
   • Dans la fenêtre suivante, cliquez sur « Voir le gel » sous l’en-tête « Options principales ». Sélectionnez l’option permettant d’exécuter un gel virtuel à 1 % à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1.
   • Une fois les résultats affichés, prenez une capture d’écran et collez-la dans un document vierge.
   • Après cela, retournez à la page principale de l’outil NEBcutter et sélectionnez « Nouveau résumé personnalisé ».
   • Cette fois-ci, recherchez l’enzyme BsrGI et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon 3.1. Sélectionnez l’enzyme et cliquez sur Digest.
   • Sous l’en-tête des options principales, cliquez sur « Afficher le gel » et sélectionnez les options pour exécuter un gel virtuel à 1 % à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1.
   • Prenez une capture d’écran des résultats et enregistrez-la dans un document texte.
   • Enfin, répétez ces étapes en utilisant à la fois StuI et BsrGI ensemble dans un seul résumé.
   • Encore une fois, faites une capture d’écran et enregistrez le gel obtenu.
3. ADN Expand
   • Avant de commencer les digestions de l’enzyme de restriction, mettez d’abord vos aliquotes d’ADN lambda, de tampon NEB 2.1, d’enzyme StuI et d’enzyme BsrGI dans un seau à glace, et apportez-le à votre zone de travail.
   • Étiquetez un tube comme StuI - cela contiendra le digest StuI.
   • Étiquetez un tube comme BsrGI pour contenir le digest BsrGI.
   • Ensuite, étiquetez un tube S+B, pour contenir le digest avec les deux enzymes.
   • Utilisez les micropipeteurs appropriés pour configurer les réactions listées dans le Tableau 1 :Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
   • Tout d’abord, pipetez les 40 μL d’eau dans chaque tube.
   • Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette à chaque fois, versez 5 μL de tampon 2.1 dans chaque tube et pipetez de haut en bas pour mélanger.
   • Ensuite, ajoutez 4 μL d’ADN lambda dans chaque tube, puis pipetez 0,5 μL de chaque enzyme dans les tubes appropriés.
   • Enfin, ajoutez une quantité suffisante d’eau dans chaque tube pour porter le volume total à 50 μL.
   • Ensuite, incubez les tubes à 37 ºC pendant 15 à 60 min dans un bain-marie, puis remettez les tampons et les enzymes dans le congélateur.
   • Pour préparer un gel d’agarose pour exécuter la digestion, dans un flacon de 250 ml, mélangez 1 g de poudre d’agarose avec 100 ml de tampon TAE.
   • Passez la solution au micro-ondes pendant environ 90 s à pleine puissance, en prenant soin d’éviter que la solution ne déborde.
   • Ensuite, retirez délicatement la solution du micro-ondes à l’aide d’un gant ou d’un coussin chauffant et placez-la à refroidir pendant environ 15 min.
   • Pendant que la solution d’agarose refroidit, installez un plateau de coulée.
   • Lorsque la solution d’agarose est froide, ajoutez 5 μL de colorant gel 10,000X SYBR Safe à la solution.
   • Ajoutez le peigne qui est utilisé pour faire les puits du gel dans le plateau de coulée de l’appareil d’électrophorèse sur gel.
   • Versez la solution de gel d’agarose dans le plateau de coulée et laissez-la se solidifier.
   • Une fois que le gel est solide, tirez le peigne vers le haut pour le retirer du gel, puis retirez les digues du plateau de coulée si nécessaire.
   • Placez le gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits positionnés le plus près de l’électrode négative ou noire et remplissez la chambre avec 1x tampon TAE pour couvrir complètement le gel.
   • Retirez vos échantillons du bain-marie.
   • Ajoutez ensuite 8,3 μL de colorant de chargement 6X à chaque échantillon.
   • Distribuez 10 μL de la digestion pBR322-BstN1 qui contient des fragments d’ADN de taille connue dans le premier puits.
   • Chargez ensuite 25 μL d’échantillon StuI dans le deuxième puits.
   • Placez 25 μL d’échantillon BsRGI dans le troisième puits.
   • Chargez 25 μL d’échantillon S+B dans le quatrième puits.
   • Pour faire fonctionner le gel, branchez les fils dans la chambre d’électrophorèse, puis dans l’alimentation. Le plomb positif rouge doit être à l’extrémité le plus éloigné des puits et le plomb négatif noir doit être le plus proche des puits. En effet, les échantillons passeront du négatif au positif.
   • Allumez l’alimentation électrique et réglez la boîte de gel pour qu’elle fonctionne à 170 volts pendant environ 60 minutes.
   • Une fois l’exécution terminée, coupez l’alimentation de la boîte de gel et débranchez les électrodes du réservoir.
   • Retirez ensuite le gel de la chambre d’électrophorèse et observez-le avec un transilluminateur UV. ATTENTION : Protégez les yeux des UV en portant des lunettes ou en utilisant l’écran fourni.
   • Enfin, utilisez l’appareil photo d’un téléphone portable pour prendre une photo du gel directement au-dessus et parallèlement à la surface du gel.
4. Résultats Expand
   • Compare le gel que tu as utilisé en laboratoire à ton digest enzymatique virtuel avec StuI.
   • Le résumé virtuel avec StuI a abouti à sept bandes. Comptez les bandes dans la voie StuI de votre gel et notez si cela correspondait au résumé virtuel ou semblait montrer un motif similaire. REMARQUE : Les petites bandes sur les gels d’électrophorèse à l’agarose sont souvent invisibles.
   • Regardez maintenant les résultats de votre résumé BsrGI. Le résumé virtuel avec BsrGI a abouti à six groupes. Comptez les groupes dans la voie BsrGI. Encore une fois, notez si le résumé virtuel et le résumé de laboratoire ont montré le même modèle ou un modèle similaire.
   • Enfin, regardez le résumé virtuel avec StuI et BsrGI. La digestion virtuelle avec les deux enzymes a donné 12 bandes. Comptez les bandes dans la voie correspondante de votre gel et demandez-vous si le motif de bandes d’ADN ressemble à la synthèse virtuelle.

Dans cette expérience, vous effectuerez l’isolement de l’ADN dans deux conditions expérimentales : l’une à l’aide d’un tampon contenant le détergent SDS et l’autre sans détergent. L’autre hypothèse de cette expérience pourrait être que l’échantillon préparé sans SDS, un détergent anionique puissant qui brise les membranes cellulaires, produira moins d’ADN que l’échantillon préparé avec SDS. L’hypothèse nulle de cette expérience pourrait être que les deux échantillons produiront une quantité égale d’ADN.

Pour commencer, prélever un échantillon de tissu pour l’isolement de l’ADN. Ici, vous utiliserez vos propres cellules de joue. Utilisez un bâtonnet de popsicle pour gratter l’intérieur de vos joues pendant environ 30 secondes.

Positionnez un entonnoir dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, prenez 10 millilitres de la solution saline à 1 % qui vous a été fournie dans une tasse étiquetée et faites-la tourner dans votre bouche sans l’avaler. Continuez à remuer pendant 90 secondes, puis crachez la solution saline contenant les cellules de vos joues dans l’entonnoir pour les recueillir dans le tube conique.

Ensuite, étiquetez deux tubes de microcentrifugation vides avec vos initiales. Étiquetez l’un des tubes comme plus SDS et l’autre comme moins SDS pour différencier les deux traitements. Ajoutez ensuite 1,5 à deux millilitres de la solution saline contenant les cellules de la joue dans chaque tube.

Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse pendant 30 secondes. Retirez les tubes de la microcentrifugeuse et versez soigneusement le surnageant sans déranger les cellules collectées au fond de chaque tube. Remplissez les tubes avec plus de solution saline contenant les cellules de la joue et répétez la centrifugation.

Répétez ce processus en prenant soin de répartir uniformément les cellules entre les tubes SDS-positifs et SDS-négatifs jusqu’à ce que toutes les cellules de la joue aient été collectées. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lyse contenant du SDS dans le tube marqué plus SDS, puis remettez en suspension la pastille de cellule en pipetant de haut en bas. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de lyse sans SDS dans le tube marqué d’une SDS négative, et remettez en suspension la pastille de cellule en pipetant de haut en bas.

Après cela, ajoutez 10 microlitres de protéinase K dans chaque tube, puis placez soigneusement les tubes dans le bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, retirez soigneusement les tubes du bain-marie et ajoutez 100 microlitres de chlorure de sodium à 2,5 molaires dans chaque tube. Fermez fermement les tubes et retournez-les plusieurs fois pour mélanger.

Ensuite, étiquetez un tube conique de 15 millilitres comme plus SDS et un autre avec moins. Versez ensuite le contenu de chaque tube de microcentrifugation dans le tube conique de 15 millilitres correspondant. Obtenez une aliquote de 10 millilitres d’éthanol à 100 % du congélateur.

Tenez l’un des tubes coniques en biais et versez lentement un millilitre d’éthanol à 100 % dans le tube pour former une couche sur le liquide déjà présent dans le tube. Répétez ce processus pour le deuxième tube conique. Regardez maintenant vos deux tubes.

Il doit y avoir un précipité filandreux présent à l’interface de l’éthanol et de la couche aqueuse située en dessous. Ce matériau filandreux contient l’ADN isolé. Prenez des photos de l’ADN dans le tube et faites des notes descriptives claires et des dessins de vos observations dans votre carnet.

Ensuite, à l’aide d’un agitateur en verre, prélevez l’ADN du tube positif au SDS et examinez-le. Répétez cette opération pour le tube négatif SDS, en enregistrant à nouveau vos observations. Maintenant, sans regarder les étiquettes, observez vos deux échantillons.

Les tubes semblent-ils contenir la même quantité d’ADN précipité ? Un tube a-t-il plus d’ADN précipité que l’autre ? À l’aide de ce que vous avez appris sur l’extraction de l’ADN et les FDS, pouvez-vous déterminer quel échantillon a été préparé avec SDS et quel échantillon a été préparé sans SDS ?

Enfin, jetez tous les déchets liquides dans le conteneur à déchets approprié et remettez tous les outils à leur emplacement approprié dans le laboratoire. Pour étudier le fonctionnement des enzymes de restriction, rendez-vous d’abord sur le site Web répertorié à l’écran. Les ressources disponibles sur ce site permettent aux chercheurs de réaliser des expériences virtuelles avant qu’elles ne soient réalisées en laboratoire.

Cliquez sur Outils et ressources pour trouver l’outil NEBcutter. Ouvrez le programme. Ensuite, à droite du champ de recherche, trouvez la liste qui indique Phage viral.

Dans cette liste, sélectionnez Lambda. C’est le nom de l’ADN que vous allez digérer. Sélectionnez l’option Linéaire à l’endroit où l’outil indique La séquence est et l’option Enzymes NEB à l’endroit où l’outil indique Enzymes à utiliser.

Cliquez ensuite sur Envoyer. La page suivante affichera une carte de restriction complète de l’ADN lambda. Cette carte de restriction peut être utilisée pour prédire ce qui se passera si certaines enzymes sont utilisées.

Ensuite, cliquez sur Résumé personnalisé sous l’en-tête Options principales. Recherchez l’enzyme Stu1 et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon CS. Sélectionnez l’enzyme Stu1 et cliquez sur Digest.

Dans la fenêtre suivante, cliquez sur Afficher le gel sous l’en-tête des options principales. Sélectionnez l’option permettant d’exécuter un 1 %gel virtuel à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1. Une fois les résultats affichés, prenez une capture d’écran et collez-la dans un document vierge.

Après cela, revenez à la page principale de l’outil NEBcutter et sélectionnez Nouveau résumé personnalisé. Cette fois, recherchez l’enzyme BsrG1 et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon 3.1. Sélectionnez l’enzyme et cliquez sur Digest.

Sous l’en-tête Options principales, cliquez sur Afficher le gel et sélectionnez les options pour exécuter un gel virtuel de 1 % à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1. Prenez une capture d’écran des résultats et enregistrez-la dans un document texte. Enfin, répétez ces étapes en utilisant à la fois Stu1 et BsrG1 dans une seule digestion.

Encore une fois, faites une capture d’écran et enregistrez le gel résultant. Avant de commencer la digestion de l’enzyme de restriction, mettez d’abord vos aliquotes d’ADN lambda, de tampon NEB 2.1, d’enzyme Stu1 et d’enzyme BsrG1 dans un seau à glace, et apportez-le à votre zone de travail. Le tube étiqueté Stu1 one contiendra le digest Stu1.

Le tube étiqueté BsrG1 contiendra le digest BsrG1. Et le tube étiqueté S plus B contiendra le digest avec les deux enzymes. Vous allez maintenant utiliser les micropipettes appropriées pour configurer les réactions répertoriées dans ce tableau.

Tout d’abord, pipetez 40 microlitres d’eau dans chaque tube. Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, distribuez à chaque fois cinq microlitres de tampon 2.1 dans chaque tube et pipetez de haut en bas pour mélanger. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d’ADN lambda dans chaque tube, puis pipetez 0,5 microlitre de chaque enzyme dans les tubes appropriés.

Enfin, ajoutez une quantité suffisante d’eau dans chaque tube pour porter le volume total à 50 microlitres. Ensuite, incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant 15 à 60 minutes dans un bain-marie et remettez les tampons et les enzymes au congélateur. Pour préparer un gel d’agarose pour faire fonctionner la digestion dans un flacon de 250 millilitres, mélangez un gramme de poudre d’agarose avec 100 millilitres de tampon TAE.

Passez la solution au micro-ondes pendant environ 90 secondes à pleine puissance en prenant soin d’éviter que la solution ne déborde. Ensuite, retirez délicatement la solution du micro-ondes à l’aide d’un gant ou d’un coussin chauffant et placez-la à refroidir pendant environ 15 minutes. Pendant que la solution d’agarose refroidit, installez un plateau de coulée.

Lorsque la solution d’agarose est froide, ajoutez une quantité appropriée de 10 000X de colorant de gel SYBR Safe à la solution. Ajoutez le peigne qui sert à faire les puits du gel dans le plateau de coulée de l’appareil d’électrophorèse sur gel. Versez la solution de gel d’agarose dans le plateau de coulée et laissez-la se solidifier.

Tirez ensuite le peigne vers le haut pour le retirer du gel. Et retirez les digues du plateau de coulée. Placez le gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits positionnés le plus près de l’électrode négative ou noire et remplissez la chambre avec 1x tampon TAE suffisant pour couvrir complètement le gel.

Retirez vos échantillons du bain-marie. Ajoutez ensuite 8,3 microlitres de colorant de chargement 6X à chaque échantillon. Distribuez 10 microlitres de la digestion pBR322-BstN1 qui contient des fragments d’ADN de taille connue dans le premier puits.

Chargez ensuite 25 microlitres d’échantillon Stu1 dans le deuxième puits. Placez 25 microlitres de l’échantillon B dans le troisième puits et enfin chargez 25 microlitres de l’échantillon SB dans le quatrième puits. Pour faire fonctionner le gel, branchez les fils dans la chambre d’électrophorèse, puis dans l’alimentation électrique.

Le plomb positif rouge doit être à l’extrémité le plus éloigné des puits et le plomb négatif noir doit être le plus proche des puits. En effet, les échantillons passeront du négatif au positif. Allumez l’alimentation électrique et réglez la boîte de gel pour qu’elle fonctionne à 170 volts pendant environ 60 minutes.

Une fois la course terminée, coupez l’alimentation de la boîte de gel et débranchez les électrodes du réservoir. Retirez ensuite le gel de la chambre d’électrophorèse et observez-le avec un transilluminateur UV. Enfin, utilisez l’appareil photo d’un téléphone portable pour prendre une photo du gel directement au-dessus et parallèlement à la surface du gel.

Comparez le gel que vous avez utilisé en laboratoire à votre digest enzymatique virtuel avec Stu1. Le condensé virtuel avec Stu1 a donné lieu à sept groupes. Comptez les bandes dans la voie Stu1 de votre gel.

Votre gel a-t-il confirmé cette prédiction ? Regardez maintenant les résultats de votre résumé BsrG1. Le résumé virtuel avec BsrG1 a abouti à six groupes.

Comptez les bandes dans la voie BsrG1. Votre gel a-t-il confirmé cette prédiction ? Enfin, regardez la synthèse virtuelle avec Stu1 et BsrG1.

La synthèse virtuelle avec les deux enzymes a donné 12 bandes. Comptez les bandes dans la voie correspondante de votre gel. Votre gel a-t-il confirmé cette prédiction ?

Le motif de bandes d’ADN ressemble-t-il au digest virtuel ?