Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?

SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.

What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?

Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.

How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?

Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.

What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?

Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.

Why are different buffers required for different restriction enzymes?

Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.

How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?

DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.

What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?

Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.

Analyse de l’enzyme d’isolement et de restriction de l’ADN

Notions Préparation de l'instructeur Protocole étudiant

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L’extraction de l’ADN est l’élimination et la purification de l’ADN des cellules. Tout d’abord, les cellules sont lysées - brisées - généralement par une combinaison de perturbation physique et de traitement avec des produits chimiques, tels qu’un détergent qui dissout la cellule et les membranes nucléaires. Le SDS ou dodécylsulfate de sodium est un détergent couramment utilisé qui agit en solubilisant les protéines et les lipides qui composent ces membranes. Le contenu peut alors flotter librement dans la solution environnante.

Ensuite, l’ADN doit être séparé des autres molécules présentes. La protéinase K ajoutée à la réaction brisera les liaisons peptidiques et digérera les protéines contaminantes. Du sel est ensuite ajouté à l’échantillon, ce qui stabilise les groupes phosphate chargés négativement dans le squelette de l’ADN et, après l’ajout d’alcool glacé, précipite l’ADN hors de la solution. Le précipité blanc est recueilli en le faisant tourner dans une centrifugeuse où il se dépose au fond du tube. Après l’avoir lavé et remis en suspension dans une solution tampon, l’ADN extrait peut enfin être utilisé dans des applications de recherche ou de biotechnologie.

Certaines applications de la biotechnologie, comme l’empreinte génétique, qui permet d’identifier de nouveaux modèles d’ADN spécifiques à un ou plusieurs individus, impliquent l’utilisation d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des molécules qui interagissent avec l’ADN et reconnaissent des séquences spécifiques. Une fois leur site spécifique identifié, ils coupent l’ADN. Cela aura pour conséquence que le brin sera coupé en un ou plusieurs morceaux linéaires. Si l’ADN extrait était un plasmide, un morceau d’ADN circulaire que l’on trouve le plus souvent chez les bactéries, toute coupure entraînera la formation d’un ou de plusieurs fragments linéaires de l’ADN. Différentes enzymes de restriction reconnaissent différentes séquences d’ADN, de sorte que l’utilisation d’une combinaison de celles-ci peut entraîner la production de fragments distincts.

Dans l’empreinte génétique, nous pouvons ensuite examiner ces fragments à l’aide d’une technique appelée électrophorèse de l’ADN ou du gel. Pour préparer des gels, l’agarose en poudre est mélangée à un tampon et chauffée jusqu’à ce qu’elle soit dissoute. Une coloration nucléotidique est ensuite ajoutée au mélange chaud, puis cette solution est versée dans le moule de coulée. Un peigne est inséré pour former les puits. Une fois solidifié, le gel est transféré dans une boîte de gel remplie de tampon et le peigne est retiré. Un mélange de référence de fragments d’ADN teinté de longueurs connues, l’échelle d’ADN, est ajouté à un puits et les échantillons d’ADN teintés d’intérêt sont chargés dans les puits restants. Le boîtier est connecté à une source d’alimentation et la mise sous tension induit la migration des groupes phosphate chargés négativement dans les nucléotides d’ADN à travers le gel vers l’anode, l’extrémité positive. Les petits morceaux se déplacent plus rapidement que les plus gros fragments, qui migrent difficilement.

Une fois l’essai terminé, le gel est exposé à la lumière ultraviolette pour visualiser la coloration nucléotidique dans les échantillons d’ADN. Leur présence peut être confirmée en fonction de leur emplacement relatif aux bandes de l’échelle. Étant donné que l’ADN avec des séquences différentes aura des sites coupés à différents endroits, cela peut produire de nouveaux modèles de bandes, ou empreintes digitales, qui peuvent être utilisés pour distinguer des individus ou des profils d’ADN variants.

Dans ce laboratoire, vous effectuerez des extractions d’ADN à l’aide d’un tampon avec et sans SDS pour évaluer l’importance des détergents dans l’isolement de l’ADN, puis digérerez l’ADN plasmidique avec différentes enzymes de restriction pour examiner les profils d’ADN résultants.

Print Procedure Steps

- NOTE : Dans cette expérience, vous allez effectuer une isolation de l’ADN dans deux conditions expérimentales : l’une en utilisant un tampon contenant la FDS de détergent et l’autre sans détergent. Hypothèses : L’autre hypothèse pour cette expérience pourrait être que l’échantillon préparé sans SDS, un détergent anionique puissant qui brise les membranes cellulaires, produira moins d’ADN que l’échantillon préparé avec SDS. L’hypothèse nulle de cette expérience pourrait être que les deux échantillons produiront une quantité égale d’ADN.
- Pour commencer à prélever un échantillon de tissu pour l’isolement de l’ADN. Ici, vous utiliserez vos propres cellules de joue. Utilisez un bâtonnet de popsicle pour gratter l’intérieur de vos joues pendant environ 30 s. IMPORTANT : Ne grattez pas assez fort pour causer de la douleur ou faire couler du sang.
- Positionnez un entonnoir dans un tube conique de 15 ml.
- Ensuite, prenez 10 ml de la solution saline à 1 % qui vous a été fournie dans une tasse étiquetée et faites-la tourner dans votre bouche sans l’avaler.
- Continuez à agiter pendant 90 s, puis crachez la solution saline contenant les cellules de votre joue dans l’entonnoir pour la recueillir dans le tube conique.
- Ensuite, étiquetez deux tubes de microcentrifugation vides avec vos initiales.
- Étiquetez l’un des tubes comme +SDS et l’autre comme -SDS pour différencier les deux traitements.
- Ajoutez ensuite 1,5 à 2 ml de la solution saline contenant les cellules de la joue dans chaque tube.
- Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse pendant 30 s.
- Retirez les tubes de la microcentrifugeuse et versez soigneusement le surnageant sans déranger les cellules collectées au fond de chaque tube.
- Remplissez les tubes avec plus de solution saline contenant les cellules de la joue et répétez la centrifugation.
- Répétez ce processus en prenant soin de répartir uniformément les cellules entre les tubes +SDS et -SDS jusqu’à ce que toutes les cellules de la joue aient été collectées.
- Ensuite, ajoutez 1 mL de tampon de lyse contenant des FDS dans le tube marqué +SDS, puis remettez en suspension la pastille de cellule en le pipetant de haut en bas.
- Ajoutez ensuite 1 mL de tampon de lyse sans SDS dans le tube marqué d’un -SDS et remettez en suspension la pastille de cellule en le pipetant de haut en bas.
- Après cela, ajoutez 10 μL de protéinase K dans chaque tube, puis placez soigneusement les tubes dans le bain-marie à 56 ºC pendant 10 min.
- Après 10 minutes, retirez soigneusement les tubes du bain-marie et ajoutez 100 μL de 2,5 M de NaCl dans chaque tube.
- Fermez fermement les tubes et retournez-les plusieurs fois pour mélanger.
- Ensuite, étiquetez un tube conique de 15 mL comme +SDS et un autre avec -SDS.
- Versez le contenu de chaque tube de microcentrifugation dans le tube conique de 15 mL correspondant.
- Obtenez une aliquote de 10 ml d’éthanol à 100 % du congélateur.
- Tenez l’un des tubes coniques en biais et versez lentement 1 mL d’éthanol à 100 % dans le tube pour former une couche sur le liquide déjà dans le tube.
- Répétez ce processus pour le deuxième tube conique.
- Regardez maintenant vos deux tubes. Il doit y avoir un précipité filandreux présent à l’interface de l’éthanol et de la couche aqueuse située en dessous. Ce matériau filandreux contient l’ADN isolé. Prenez des photos de l’ADN dans le tube et faites des notes descriptives claires et des dessins de vos observations dans votre carnet.
- À l’aide d’un agitateur en verre, prélevez l’ADN du tube +SDS et examinez-le. Répétez cette opération pour le tube -SDS, en enregistrant à nouveau vos observations. Notez si l’un des tubes semble avoir plus de précipité que l’autre, et pourquoi cela pourrait être.
- Enfin, jetez tous les déchets liquides dans le conteneur à déchets approprié et remettez tous les outils à leur emplacement approprié dans le laboratoire.
Enzyme de restriction Digestion virtuelle
- Pour étudier le fonctionnement des enzymes de restriction, rendez-vous d’abord sur le site Web de New England Biolabs : https://www.neb.com/
- Les ressources disponibles sur ce site permettent aux chercheurs de réaliser des expériences virtuelles avant qu’elles ne soient réalisées en laboratoire. Cliquez sur « Outils et ressources » pour trouver l’outil NEBcutter et ouvrir le programme.
- À droite du champ de recherche, trouvez la liste qui dit « Viral + phage ». Dans cette liste, sélectionnez Lambda. C’est le nom de l’ADN que vous allez digérer. Sélectionnez l’option Linéaire où l’outil indique « la séquence est » et l’option « Enzymes NEB » où l’outil indique « Enzymes à utiliser ». Cliquez ensuite sur Envoyer.
- La page suivante affichera une carte de restriction complète de l’ADN lambda. Cette carte de restriction peut être utilisée pour prédire ce qui se passera si certaines enzymes sont utilisées. Ensuite, cliquez sur « Résumé personnalisé » sous la rubrique « Options principales ».
- Recherchez l’enzyme StuI et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon CS. Sélectionnez l’enzyme StuI et cliquez sur Digest.
- Dans la fenêtre suivante, cliquez sur « Voir le gel » sous l’en-tête « Options principales ». Sélectionnez l’option permettant d’exécuter un gel virtuel à 1 % à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1.
- Une fois les résultats affichés, prenez une capture d’écran et collez-la dans un document vierge.
- Après cela, retournez à la page principale de l’outil NEBcutter et sélectionnez « Nouveau résumé personnalisé ».
- Cette fois-ci, recherchez l’enzyme BsrGI et notez qu’elle fonctionne de manière optimale dans le tampon 2.1 ou le tampon 3.1. Sélectionnez l’enzyme et cliquez sur Digest.
- Sous l’en-tête des options principales, cliquez sur « Afficher le gel » et sélectionnez les options pour exécuter un gel virtuel à 1 % à l’aide d’un condensé pBR322-BstN1.
- Prenez une capture d’écran des résultats et enregistrez-la dans un document texte.
- Enfin, répétez ces étapes en utilisant à la fois StuI et BsrGI ensemble dans un seul résumé.
- Encore une fois, faites une capture d’écran et enregistrez le gel obtenu.
ADN
- Avant de commencer les digestions de l’enzyme de restriction, mettez d’abord vos aliquotes d’ADN lambda, de tampon NEB 2.1, d’enzyme StuI et d’enzyme BsrGI dans un seau à glace, et apportez-le à votre zone de travail.
- Étiquetez un tube comme StuI - cela contiendra le digest StuI.
- Étiquetez un tube comme BsrGI pour contenir le digest BsrGI.
- Ensuite, étiquetez un tube S+B, pour contenir le digest avec les deux enzymes.
- Utilisez les micropipeteurs appropriés pour configurer les réactions listées dans le Tableau 1 :Cliquez ici pour télécharger le Tableau 1
- Tout d’abord, pipetez les 40 μL d’eau dans chaque tube.
- Ensuite, à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette à chaque fois, versez 5 μL de tampon 2.1 dans chaque tube et pipetez de haut en bas pour mélanger.
- Ensuite, ajoutez 4 μL d’ADN lambda dans chaque tube, puis pipetez 0,5 μL de chaque enzyme dans les tubes appropriés.
- Enfin, ajoutez une quantité suffisante d’eau dans chaque tube pour porter le volume total à 50 μL.
- Ensuite, incubez les tubes à 37 ºC pendant 15 à 60 min dans un bain-marie, puis remettez les tampons et les enzymes dans le congélateur.
- Pour préparer un gel d’agarose pour exécuter la digestion, dans un flacon de 250 ml, mélangez 1 g de poudre d’agarose avec 100 ml de tampon TAE.
- Passez la solution au micro-ondes pendant environ 90 s à pleine puissance, en prenant soin d’éviter que la solution ne déborde.
- Ensuite, retirez délicatement la solution du micro-ondes à l’aide d’un gant ou d’un coussin chauffant et placez-la à refroidir pendant environ 15 min.
- Pendant que la solution d’agarose refroidit, installez un plateau de coulée.
- Lorsque la solution d’agarose est froide, ajoutez 5 μL de colorant gel 10,000X SYBR Safe à la solution.
- Ajoutez le peigne qui est utilisé pour faire les puits du gel dans le plateau de coulée de l’appareil d’électrophorèse sur gel.
- Versez la solution de gel d’agarose dans le plateau de coulée et laissez-la se solidifier.
- Une fois que le gel est solide, tirez le peigne vers le haut pour le retirer du gel, puis retirez les digues du plateau de coulée si nécessaire.
- Placez le gel dans la chambre d’électrophorèse avec les puits positionnés le plus près de l’électrode négative ou noire et remplissez la chambre avec 1x tampon TAE pour couvrir complètement le gel.
- Retirez vos échantillons du bain-marie.
- Ajoutez ensuite 8,3 μL de colorant de chargement 6X à chaque échantillon.
- Distribuez 10 μL de la digestion pBR322-BstN1 qui contient des fragments d’ADN de taille connue dans le premier puits.
- Chargez ensuite 25 μL d’échantillon StuI dans le deuxième puits.
- Placez 25 μL d’échantillon BsRGI dans le troisième puits.
- Chargez 25 μL d’échantillon S+B dans le quatrième puits.
- Pour faire fonctionner le gel, branchez les fils dans la chambre d’électrophorèse, puis dans l’alimentation. Le plomb positif rouge doit être à l’extrémité le plus éloigné des puits et le plomb négatif noir doit être le plus proche des puits. En effet, les échantillons passeront du négatif au positif.
- Allumez l’alimentation électrique et réglez la boîte de gel pour qu’elle fonctionne à 170 volts pendant environ 60 minutes.
- Une fois l’exécution terminée, coupez l’alimentation de la boîte de gel et débranchez les électrodes du réservoir.
- Retirez ensuite le gel de la chambre d’électrophorèse et observez-le avec un transilluminateur UV. ATTENTION : Protégez les yeux des UV en portant des lunettes ou en utilisant l’écran fourni.
- Enfin, utilisez l’appareil photo d’un téléphone portable pour prendre une photo du gel directement au-dessus et parallèlement à la surface du gel.
Résultats
- Compare le gel que tu as utilisé en laboratoire à ton digest enzymatique virtuel avec StuI.
- Le résumé virtuel avec StuI a abouti à sept bandes. Comptez les bandes dans la voie StuI de votre gel et notez si cela correspondait au résumé virtuel ou semblait montrer un motif similaire. REMARQUE : Les petites bandes sur les gels d’électrophorèse à l’agarose sont souvent invisibles.
- Regardez maintenant les résultats de votre résumé BsrGI. Le résumé virtuel avec BsrGI a abouti à six groupes. Comptez les groupes dans la voie BsrGI. Encore une fois, notez si le résumé virtuel et le résumé de laboratoire ont montré le même modèle ou un modèle similaire.
- Enfin, regardez le résumé virtuel avec StuI et BsrGI. La digestion virtuelle avec les deux enzymes a donné 12 bandes. Comptez les bandes dans la voie correspondante de votre gel et demandez-vous si le motif de bandes d’ADN ressemble à la synthèse virtuelle.