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La révélation que l’ADN est la molécule héréditaire de tous les organismes a conduit à d’énormes percées scientifiques et médicales et a considérablement amélioré notre compréhension de nous-mêmes et des autres organismes. L’isolement et le profilage de l’ADN ont été les premières étapes fondamentales de nombreuses avancées du siècle dernier ; de l’identification de la fonction des gènes aux révolutions de l’agriculture et de la médecine légale.
L’isolement de l’ADN est une procédure assez simple qui nécessite peu d’étapes mais essentielles : récolte de cellules, lyse, dégradation des protéines et enfin précipitation de l’ADN. En général, l’ADN peut être récolté à partir de petites quantités de tissus, tels qu’une seule feuille d’une plante, des follicules pileux d’animaux ou des cellules épithéliales qui peuvent être facilement éliminées dans la bouche avec une simple solution saline. Étant donné que l’ADN est compartimenté à l’intérieur du noyau ou des mitochondries dans les cellules eucaryotes, les scientifiques décomposent d’abord la cellule et la membrane nucléaire pour exposer l’ADN, ce qui se fait avec l’étape de lyse. Cependant, une fois que l’ADN est exposé, il peut être dégradé par des ions de métaux lourds et des pH extrêmes. Par conséquent, une solution tampon contenant un détergent est utilisée non seulement pour dissoudre la membrane cellulaire, mais également pour protéger l’ADN des éléments dégradants dans la solution. De plus, l’ADN est une molécule inhabituellement longue qui est condensée à l’intérieur du noyau en s’agglomérant étroitement autour de protéines spéciales appelées histones. Par conséquent, une enzyme appelée protéinase K, qui dégrade les liaisons peptidiques des protéines, est ajoutée pour séparer l’ADN des histones et autres protéines. Ensuite, les scientifiques séparent l’ADN du reste de l’extrait cellulaire en utilisant ses propriétés chimiques. En raison de la structure chargée négativement des acides nucléiques, les ions Na+ dans une solution de chlorure de sodium se lient et s’intègrent dans des brins d’ADN intriqués. Une fois que l’ADN est agglutiné, il peut être observé à l’œil nu. L’ADN est insoluble dans l’alcool et précipite facilement à basse température, c’est pourquoi les scientifiques ajoutent de l’alcool froid pour précipiter l’ADN. Enfin, l’ADN précipité peut être dissous et stocké dans de l’eau déminéralisée ou un tampon doux, exempt de toute enzyme susceptible de dégrader les acides nucléiques, jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
Les réactions qui utilisent l’ADN nécessitent souvent une grande pureté et des quantités précises d’ADN. Par conséquent, après l’isolement de l’ADN, les scientifiques utilisent un spectrophotomètre pour quantifier la quantité d’ADN dans leur échantillon, ainsi que la pureté de l’ADN dans l’échantillon. Un spectrophotomètre mesure l’intensité d’un faisceau lumineux traversant un échantillon en fonction de sa longueur d’onde. Les acides nucléiques absorbent la lumière à 260 nm, tandis que les protéines absorbent la lumière à 280 nm. En mesurant l’intensité d’un faisceau lumineux à 260 nm, les scientifiques peuvent déterminer la concentration d’ADN. De plus, en évaluant l’intensité lumineuse à la fois à 260 nm et à 280 nm, la pureté du contenu en ADN peut être déterminée. Dans un échantillon d’ADN pur, le rapport 260/280 nm doit approcher la valeur de 2.
Pour un certain nombre d’analyses, telles que le clonage, le séquençage et la cartographie des fragments d’ADN et des génomes, l’ADN isolé doit être coupé à des séquences spécifiques à l’aide d’enzymes de restriction. Ces enzymes sont produites par les bactéries en tant que mécanismes de l’immunité innée contre l’ADN viral intrusif et fonctionnent comme des ciseaux moléculaires. Par conséquent, une fois que les enzymes de restriction ont identifié un ADN viral, elles commencent à le décomposer en le coupant en segments au niveau de certaines séquences nucléotidiques qu’elles reconnaissent. Ces séquences nucléotidiques ont souvent une longueur de six à douze nucléotides et sont généralement palindromiques, ce qui signifie qu’elles ont la même séquence nucléotidique dans les directions 3'-5' et 5'-3'. Par exemple, l’enzyme de restriction EcoRI coupe l’ADN à la séquence 3'... GAATTC...-5', qui se lit de la même manière dans le sens 5'-3'. Comme EcoRI, il existe des centaines d’enzymes qui correspondent à de nombreuses séquences palindromiques distinctes. Une fois que l’ADN est coupé par ces enzymes, les scientifiques peuvent charger l’ADN sur un gel dans une chambre d’électrophorèse et faire passer le courant électrique à travers le gel. L’ADN porte des charges négatives, ce qui fait migrer les fragments d’ADN vers l’anode. Cependant, les pores du gel ralentissent les fragments d’ADN plus grands par rapport aux séquences d’ADN plus petites, de sorte que les morceaux se séparent en fonction de leur taille. Une fois l’électrophorèse terminée, les fragments d’ADN peuvent être visualisés à l’aide de colorants qui se lient spécifiquement aux molécules d’ADN.
La coupe de l’ADN avec des enzymes de restriction et la séparation des fragments d’ADN par électrophorèse permettent aux chercheurs d’identifier la taille de fragments inconnus par rapport à une échelle standard. Ces fragments d’intérêt peuvent ensuite être isolés et ligaturés dans un vecteur plasmidique pour le clonage génétique. Le génie génétique et les analyses de laboratoire ont été considérablement améliorés grâce à ces méthodes. Grâce au profilage de l’ADN, les scientifiques sont en mesure de séquencer les génomes pour mieux comprendre le fonctionnement des organismes et sont également en mesure d’identifier et de caractériser certains gènes1.
L’isolement et le profilage de l’ADN sont également pratiques pour les événements ayant un impact direct sur la vie quotidienne. Par exemple, les experts en médecine légale analysent régulièrement des échantillons d’ADN pour fournir des preuves dans des affaires criminelles et civiles2. De même, les travailleurs de la santé extraient et analysent l’ADN pour vérifier la paternité et les maladies génétiques. Récemment, les kits d’analyse d’ascendance ADN sont devenus populaires en permettant aux utilisateurs de déterminer leur lignée génétique, de trouver des parents et même de découvrir leur disposition génétique à divers problèmes de santé3. Enfin, avec les progrès de la biotechnologie et du génie génétique, la médecine personnalisée gagne du terrain parmi les chercheurs cliniques pour développer des traitements en utilisant les données génétiques d’un individu, ouvrant la voie à un traitement efficace des patients sans effets secondaires néfastes4.
L’extraction de l’ADN est l’élimination et la purification de l’ADN des cellules. Tout d’abord, les cellules sont lysées - brisées - généralement par une combinaison de perturbation physique et de traitement avec des produits chimiques, tels qu’un détergent qui dissout la cellule et les membranes nucléaires. Le SDS ou dodécylsulfate de sodium est un détergent couramment utilisé qui agit en solubilisant les protéines et les lipides qui composent ces membranes. Le contenu peut alors flotter librement dans la solution environnante.
Ensuite, l’ADN doit être séparé des autres molécules présentes. La protéinase K ajoutée à la réaction brisera les liaisons peptidiques et digérera les protéines contaminantes. Du sel est ensuite ajouté à l’échantillon, ce qui stabilise les groupes phosphate chargés négativement dans le squelette de l’ADN et, après l’ajout d’alcool glacé, précipite l’ADN hors de la solution. Le précipité blanc est recueilli en le faisant tourner dans une centrifugeuse où il se dépose au fond du tube. Après l’avoir lavé et remis en suspension dans une solution tampon, l’ADN extrait peut enfin être utilisé dans des applications de recherche ou de biotechnologie.
Certaines applications de la biotechnologie, comme l’empreinte génétique, qui permet d’identifier de nouveaux modèles d’ADN spécifiques à un ou plusieurs individus, impliquent l’utilisation d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des molécules qui interagissent avec l’ADN et reconnaissent des séquences spécifiques. Une fois leur site spécifique identifié, ils coupent l’ADN. Cela aura pour conséquence que le brin sera coupé en un ou plusieurs morceaux linéaires. Si l’ADN extrait était un plasmide, un morceau d’ADN circulaire que l’on trouve le plus souvent chez les bactéries, toute coupure entraînera la formation d’un ou de plusieurs fragments linéaires de l’ADN. Différentes enzymes de restriction reconnaissent différentes séquences d’ADN, de sorte que l’utilisation d’une combinaison de celles-ci peut entraîner la production de fragments distincts.
Dans l’empreinte génétique, nous pouvons ensuite examiner ces fragments à l’aide d’une technique appelée électrophorèse de l’ADN ou du gel. Pour préparer des gels, l’agarose en poudre est mélangée à un tampon et chauffée jusqu’à ce qu’elle soit dissoute. Une coloration nucléotidique est ensuite ajoutée au mélange chaud, puis cette solution est versée dans le moule de coulée. Un peigne est inséré pour former les puits. Une fois solidifié, le gel est transféré dans une boîte de gel remplie de tampon et le peigne est retiré. Un mélange de référence de fragments d’ADN teinté de longueurs connues, l’échelle d’ADN, est ajouté à un puits et les échantillons d’ADN teintés d’intérêt sont chargés dans les puits restants. Le boîtier est connecté à une source d’alimentation et la mise sous tension induit la migration des groupes phosphate chargés négativement dans les nucléotides d’ADN à travers le gel vers l’anode, l’extrémité positive. Les petits morceaux se déplacent plus rapidement que les plus gros fragments, qui migrent difficilement.
Une fois l’essai terminé, le gel est exposé à la lumière ultraviolette pour visualiser la coloration nucléotidique dans les échantillons d’ADN. Leur présence peut être confirmée en fonction de leur emplacement relatif aux bandes de l’échelle. Étant donné que l’ADN avec des séquences différentes aura des sites coupés à différents endroits, cela peut produire de nouveaux modèles de bandes, ou empreintes digitales, qui peuvent être utilisés pour distinguer des individus ou des profils d’ADN variants.
Dans ce laboratoire, vous effectuerez des extractions d’ADN à l’aide d’un tampon avec et sans SDS pour évaluer l’importance des détergents dans l’isolement de l’ADN, puis digérerez l’ADN plasmidique avec différentes enzymes de restriction pour examiner les profils d’ADN résultants.
