How does mobile phase composition affect compound separation in thin-layer chromatography?

Mobile phase polarity directly influences how far compounds travel on the stationary phase. Pure hexane, an apolar solvent, causes polar compounds like phenol and benzoic acid to move minimally, preventing effective separation. A 60/40 hexane-ethyl acetate mixture, moderately polar, allows compounds to travel farther and space farther apart, enabling better differentiation based on their individual polarities.

What does the Rf value tell you about a compound in TLC?

The Rf value is the ratio of the distance a compound travels from the starting line to the distance the solvent front travels. It quantifies how strongly a compound interacts with the stationary phase relative to the mobile phase. Compounds with lower Rf values have higher affinity for silica gel, while those with higher Rf values interact more strongly with the mobile phase and travel farther.

Why is proper TLC plate handling important before spotting compounds?

TLC plates must be held only by their edges or top with tweezers to prevent damaging or contaminating the silica gel layer. Chips or scratches in the silica gel compromise separation quality and can cause irregular solvent flow. Undamaged plates ensure consistent, reliable results when you apply samples and develop the chromatogram.

How do you identify an unknown compound using reference standards on TLC?

Run the unknown sample alongside reference compounds on the same TLC plate using the same mobile phase. After development and visualization, compare the unknown's spot position and Rf value to those of the reference standards. If the unknown's spot aligns with a reference spot, that compound is present. Multiple spots indicate a mixture of compounds.

What is the purpose of using UV light and iodine vapor to visualize TLC plates?

UV light reveals compounds through fluorescent markers in the silica gel, making spots visible as dark areas against a glowing green background. Iodine vapor creates brown and yellow spots by reacting with organic compounds, providing an alternative visualization method. Using both techniques ensures comprehensive spot detection and accurate compound identification.

Why must the solvent level be below the sample spots when developing a TLC plate?

If the solvent level contacts the spots initially, capillary action will draw solvent directly into the samples, causing them to dissolve and spread excessively. This ruins the separation and makes accurate measurements impossible. Proper solvent positioning ensures samples migrate upward through the stationary phase in a controlled, predictable manner.

How does compound polarity relate to separation on a polar stationary phase?

On polar silica gel, less polar compounds have lower affinity and travel farther, while more polar compounds bind strongly and travel less. Benzoic acid, the most polar compound tested, showed the lowest Rf value, whereas butyl phenyl ether, the least polar, showed the highest. This inverse relationship between polarity and distance traveled enables effective separation and identification.

Chromatographie sur couche mince

Notions Préparation de l'instructeur Protocole étudiant

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La chromatographie sur couche mince, ou CCM, est une technique utilisée pour séparer les composés organiques en fonction des différences de leurs polarités. Un système CCM comporte trois composants : la phase stationnaire, le soluté et le solvant de développement.

La phase stationnaire est la surface sur laquelle les composés seront séparés, qui est généralement composée de gel de silice extrêmement polaire. Les composés ou mélanges analysés sont les solutés. Des solutions diluées de solutés sont repérées sur un bord de la plaque à l’aide de capillaires minces.

Le fond de la plaque est ensuite immergé dans le solvant de développement, qui est généralement un solvant organique moins polaire que la phase stationnaire. Le solvant se déplace vers le haut de la plaque par capillarité. Lorsque le solvant passe à travers les points de soluté, il emporte une partie de chaque soluté avec lui. Ce mélange soluté-solvant est la phase mobile.

Le sommet de la phase mobile est appelé front solvant. Au fur et à mesure que la phase mobile se déplace vers le haut de la plaque, les molécules de soluté et de solvant adhèrent temporairement à la phase stationnaire en fonction de leur polarité.

Les solutés plus polaires sont fortement attirés par la phase stationnaire, de sorte qu’ils collent plus souvent et restent coincés pendant un certain temps. Les solutés moins polaires collent moins souvent et ne restent pas coincés longtemps. Cela signifie que les solutés moins polaires passent plus de temps dans la phase mobile que les solutés plus polaires. En d’autres termes, moins de solutés polaires se déplacent plus rapidement que plus de solutés polaires.

Pour obtenir une bonne séparation entre les composés, le solvant doit être juste assez polaire pour déplacer le soluté le plus polaire. Voici quelques solvants courants par ordre croissant de polarité. Parfois, deux solvants sont combinés pour atteindre la polarité souhaitée.

Parce que la plupart des composés organiques sont blancs ou incolores, les plaques TLC contiennent généralement un composé fluorescent. Sous la lumière UV, les composés organiques apparaîtront sous forme de taches sombres sur la plaque lumineuse.

Une fois les composés visualisés, vous pouvez mesurer la distance qu’ils ont parcourue et calculer le facteur de retard, ou R_f, pour chacun d’eux. Cette valeur est la distance parcourue par le soluté divisée par la distance totale parcourue par la phase mobile.

Si le solvant est choisi correctement, chaque soluté aura un R_f nettement différent. Cela nous permet d’identifier les composés constitutifs des mélanges en faisant correspondre les valeurs R_faux composés connus.

Dans cet atelier, vous allez utiliser TLC pour déterminer le R_f de plusieurs composés connus, puis vous allez utiliser ces valeurs R_f pour déterminer l’identité d’un composé inconnu.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Source : Lara Al Hariri et Ahmed Basabrain de l’Université du Massachusetts Amherst, MA, États-Unis

Effets de la composition en phase mobile sur la séparation des composés
Dans cette section du laboratoire, vous allez utiliser la CCM pour comparer la capacité de l’hexane pur et d’un mélange de 60 % d’hexane et de 40 % d’acétate d’éthyle à séparer le phénol, l’acide benzoïque et le butylphényléther en mesurant la distance parcourue par le composé dans chaque solvant.
- Avant de commencer le laboratoire, enfile une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile. Remarque : L’hexane et l’acétate d’éthyle sont tous deux volatils, toxiques et inflammables, alors travaillez toujours avec eux dans une hotte. Changez vos gants si vous avez du solvant dessus, car l’hexane et l’acétate d’éthyle imprégneront les gants en nitrile en quelques minutes.
- Maintenant, procurez-vous une serviette en papier et posez-la sur la paillasse. Prenez soigneusement une plaque TLC à l’aide d’une pince à épiler à l’extrémité de la plaque. note: Tenez toujours les plaques TLC par les bords ou tout en haut avec une pince à épiler pour éviter d’endommager ou de contaminer le gel de silice.
- Recherchez des éclats ou des rayures dans le gel de silice et procurez-vous une nouvelle plaque si nécessaire. Ce n'est pas grave s'il y a un peu d'écaillage à une seule extrémité, car cela peut être le haut.
- Placez la plaque sur l’essuie-tout de votre hotte et posez une règle métrique à côté. À l’aide d’un crayon graphite, faites doucement une petite marque sur le gel de silice à ~1 cm du haut de la plaque. Écrivez « 100 » sur la plaque au-dessus de la marque.
- Ensuite, marquez doucement la plaque à 1 cm au-dessus du bas des deux côtés. Tracez soigneusement une ligne droite entre les marques du bas pour former la ligne de départ.
- Ensuite, ajoutez 3 petites marques régulièrement espacées sur la ligne de départ avec les marques extérieures à au moins 0,5 cm des côtés de la plaque. note: Il est important que le gel de silice ne soit pas endommagé ici, donc si vous le grattez avec le crayon, préparez une nouvelle plaque.
- Maintenant, tracez le contour de la plaque TLC dans votre cahier de laboratoire et copiez précisément les marques sur la plaque. Étiquetez les trois marques comme « phénol », « acide benzoïque » et « éther butylphénylique ». Vous pouvez également étiqueter les marques sur la plaque elle-même.
- Préparez une deuxième plaque de CCM étiquetée '60/40' de la même manière. Maintenant, apportez les plaques étiquetées sur la paillasse commune et localisez les solutions de 1 mg/mL de phénol, d’acide benzoïque et de butylphényléther dans l’éthanol.
- Trempez un capillaire propre dans l’une des trois solutions. Tamponnez brièvement et légèrement le capillaire contre l’intersection entre la ligne de départ et la marque de ce composé. Vous devriez repérer deux fois pour chaque composé.
- Utilisez le même capillaire pour repérer la même solution sur votre deuxième plaque de CCM. Les taches ne doivent pas avoir plus de 2 mm de diamètre. Ensuite, jetez le capillaire et fermez le flacon.
- Repérez les deux autres solutions sur les plaques, de la même manière, en utilisant des capillaires propres. Veillez à ne pas contaminer les solutions. Remarque : Si un point est très clair ou très petit, attendez qu’il sèche, puis repérez la même solution sur le point sec. Si l’endroit est encore humide, l’action capillaire pourrait le rendre trop large et dilué.
- Une fois que vous avez fait trois taches sur chaque plaque, jetez les capillaires et ramenez les plaques à votre capuche. Gardez les assiettes à plat pendant qu’elles sèchent.
- Maintenant, étiquetez un pot de 50 ml '100 % hexane' et amenez le pot, son bouchon et un cylindre gradué de 10 ml dans le capot de solvant.
- Mesurez 2 à 3 ml d’hexane pur avec votre cylindre gradué et versez-le dans le bocal pour le remplir à une profondeur de 0,62 à 0,7 cm. Fermez la bouteille et le bocal et remettez-les dans votre hotte.
- Étiquetez un deuxième pot de 50 ml '60 % d’hexane, 40 % d’acétate d’éthyle' et apportez-le, ainsi qu’un cylindre gradué propre, dans le capot de solvant. Mesurez 2 à 3 ml du mélange 60/40 dans le bocal et remettez-le dans votre hotte.
- Placez les plaques à côté des bocaux pour comparer la position relative du solvant et les taches. Le niveau de solvant doit être inférieur aux taches pour chaque plaque.
- Ensuite, prélevez trois morceaux de papier filtre, placez un papier filtre à la verticale contre la paroi de chaque pot, puis fermez hermétiquement les pots.
- Paraphe chaque plaque au-dessus de la marque afin de pouvoir les identifier plus tard. Vérifiez que les papiers-filtres dans les bocaux sont saturés de solvant et que les taches sur les plaques sont complètement sèches.
- Maintenant, ouvrez le pot 100 % hexane et utilisez une pince à épiler pour placer doucement la plaque 100 dans le pot, en maintenant la plaque au niveau de la surface du solvant lorsqu’elle pénètre dans le solvant. Fermez bien le bocal en faisant attention de ne pas bousculer l’assiette.
- Laissez le pot immobile pendant que le solvant remonte sur la plaque. Le développement de l’hexane pur prend généralement environ 7 à 10 minutes. Gardez un œil sur la plaque pour vous assurer que le solvant n'atteint pas le haut.
- Lorsque la face avant du solvant hexane pur se trouve à environ 1 cm du haut de la plaque, récupérez-le à l’aide d’une pince à épiler. Posez-le sur l’essuie-tout avec le gel de silice vers le haut et marquez rapidement le front du solvant avec une ligne et un crayon sur la plaque. Laissez la plaque à plat pendant que le solvant s’évapore.
- Placez l’autre plaque dans l’éluant 60/40 de la même manière. Attendez que la face du solvant de la plaque 60/40 soit à environ 1 cm du haut, puis récupérez-la et marquez rapidement la façade du solvant de la même manière.
- Une fois que la plaque 100 % hexane est complètement sèche, ramassez-la avec une pince à épiler et apportez-la avec un crayon à la lampe UV sur le banc commun.
- Placez la plaque sous la lampe et éclairez-la avec de la lumière UV. La plaque brillera en vert à cause d’un marqueur fluorescent dans la couche de gel de silice. Les taches brunes sont les composés.
- Tracez soigneusement chaque point au crayon, même s'ils n'ont pas bougé très loin.
- Ensuite, éteignez la lampe et apportez votre assiette à la hotte de développement iodée. Ouvrez la chambre à iode. À l’aide d’une pince à épiler, placez délicatement la plaque à la verticale dans la chambre à iode, puis couvrez à nouveau la chambre.
- Attendez 3 à 4 min que la vapeur d’iode reste dans les spots. Ensuite, récupérez l’assiette à l’aide d’une pince à épiler, fermez la chambre et tracez le contour des taches brunes et jaunes sur l’assiette. Ces taches s’estomperont, alors marquez-les rapidement.
- Visualisez la plaque sèche 60/40 sous la lumière UV puis avec de la vapeur d’iode de la même manière. note: Pour éviter les réactions secondaires, vérifiez toujours les plaques sous la lumière UV avant de les exposer à l’iode.
- Maintenant, copiez précisément les taches et les façades de solvant sur les dessins correspondants des plaques dans votre cahier de laboratoire. Pour chaque plaque, mesurez et notez la hauteur de la face du solvant par rapport à la ligne de départ.
- Enfin, mesurez la distance entre le centre de chaque point et sa ligne de départ, et notez-la dans votre cahier de laboratoire. Vous pouvez maintenant passer à la partie suivante de l’atelier.
composé inconnu
Dans la deuxième moitié du laboratoire, vous utiliserez la CCM pour découvrir ce qu'il y a dans un analgésique inconnu. Il pourrait contenir un ou plusieurs de ces composés : aspirine, caféine et acétaminophène. Ces composés sont hautement polaires, vous utiliserez donc un mélange préfabriqué de 90 % d'acétate d'éthyle et de 10 % d'hexane comme éluant.

Vous exécuterez les trois composés de référence et l'inconnu sur la même plaque. Plus tard, vous utiliserez les valeurs Rf des composés de référence pour identifier l'inconnu. Tout d’abord, vérifiez le matériel inconnu que vous avez été chargé d’analyser avant de commencer.
- Maintenant, posez une serviette en papier propre dans le capot et obtenez une nouvelle plaque TLC. Préparez la première marque et la ligne de départ de la même manière que précédemment. Faites quatre tiques régulièrement espacées sur la plaque, en vous assurant que les marques extérieures sont à au moins 0,5 cm des bords.
- Dessine une copie exacte de la plaque dans ton cahier de laboratoire et étiquette les coches comme 'aspirine', 'acétaminophène', 'caféine' et 'inconnu'.
- Maintenant, apportez votre assiette sur le banc commun. Repérez les solutions d’aspirine, d’acétaminophène, de caféine et de l’inconnu qui vous a été attribué sur les marques appropriées en utilisant un capillaire propre pour chaque solution. note: Lorsque vous repérez la solution inconnue, ne plongez pas trop le capillaire dans le flacon de solution pour éviter de boucher votre capillaire avec un matériau insoluble provenant de la substance inconnue.
- Jetez les capillaires et fermez les flacons avant de ramener la plaque dans votre hotte. Placez l’assiette sur une serviette en papier pour terminer le séchage.
- Ensuite, étiquetez un pot à vis de 50 ml propre contenant 90 % d’acétate d’éthyle, 10 % d’hexane, et apportez-le dans un cylindre gradué propre jusqu’au capot de solvant.
- Placez 2 à 3 ml de la solution 90/10 dans le bocal et retournez dans votre hotte. Confirmez que le niveau de solvant sera inférieur aux points sur la plaque. Ensuite, placez un papier filtre propre à la verticale dans le bocal et fermez-le hermétiquement.
- Une fois que la plaque CCM est sèche et que le papier filtre est saturé, placez soigneusement la plaque dans le solvant. note: Il est essentiel de maintenir la plaque à niveau lorsque vous faites cela. Si le front du solvant est diagonal, la distance parcourue par le solvant sera différente pour chaque point, ce qui rendra impossible la comparaison visuelle de l’inconnu aux points de référence.
- Attendez que la façade du solvant atteigne 1 cm du haut de la plaque. Ensuite, récupérez la plaque, marquez-la à l’avant du solvant et laissez-la sécher à plat.
- Une fois que la plaque est sèche, visualisez-la à la lumière UV et dans la chambre à iode, et tracez les taches au crayon.
- Le matériau inconnu pourrait être un mélange de composés, alors cherchez soigneusement les points en ligne avec les trois points de référence.
- Ensuite, copiez précisément les taches sur le dessin de la plaque dans votre cahier de laboratoire. Mesurer et noter la hauteur du front de solvant et les points par rapport à la ligne de départ.
- Lorsque vous avez terminé, récupérez les papiers filtres saturés de solvant dans les bocaux et laissez-les sécher dans le capot.
- Versez les solvants restants dans les déchets organiques standard, lavez votre verrerie en suivant les méthodes habituelles de votre laboratoire et rangez votre matériel de laboratoire.
- Jetez les plaques TLC usagées dans la poubelle du laboratoire ou avec les déchets de verre, en fonction du matériau de support.
- Enfin, une fois que les filtres sont secs, jetez-les avec tous les déchets restants.
Results
- Calculez les valeurs R_f pour le phénol, l’acide benzoïque et le butylphényléther élué avec 100 % d’hexane. Pour chaque composé sur la plaque TLC, mesurez la distance entre la ligne de départ et le centre de son emplacement. Ensuite, divisez cette valeur par la distance entre la ligne de départ et le front du solvant.
- Seul l’éther butylphénylique s’est déplacé d’une distance mesurable par rapport à la ligne de départ, ce qui est cohérent avec le fait qu’il s’agit de la moins polaire. Pour une séparation efficace, les valeurs R_f doivent différer de 0,3 à 0,7. Ainsi, nous pouvons en déduire que le phénol et l’acide benzoïque sont trop polaires pour être séparés efficacement par un solvant apolaire comme l’hexane pur.
- Calculez les valeurs R_f pour la plaque que vous avez passée dans un mélange 60/40 d’hexane et d’acétate d’éthyle. L’acétate d’éthyle est un solvant modérément polaire, de sorte que les composés se déplacent plus loin et sont plus espacés sur la plaque.
- L’ordre de séparation montre que l’acide benzoïque, le composé le plus polaire, avait la plus grande affinité pour le gel de silice, tandis que le butyl phényléther le moins polaire, avait la plus faible affinité pour le gel de silice. Cela est cohérent avec l’hypothèse selon laquelle moins de composés polaires voyagent plus loin sur les phases stationnaires polaires.
- Regardez votre troisième assiette et calculez les valeurs R_f pour l’aspirine, l’acétaminophène et la caféine. La caféine, le complexe le plus polaire des trois, a le moins voyagé. L’acétaminophène a voyagé le deuxième plus loin, tandis que l’aspirine, la moins polaire, a voyagé le plus.
- Enfin, identifiez les composés de votre matériau inconnu en comparant son ou ses points aux trois points de référence.

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Compound Separation