15.10: RT-PCR en temps réel

La réaction en chaîne par polymérase-transcription inverse en temps réel, ou RT-PCR en temps réel, est un outil analytique utilisé pour déterminer le niveau d'expression des gènes cibles. La méthode consiste à convertir l’ARNm en ADN complémentaire à l’aide d’une enzyme appelée transcriptase inverse, suivie de l’amplification PCR de l’ADNc. Ces deux processus peuvent être effectués simultanément dans un seul tube ou séparément sous forme de réaction en deux étapes.

La quantification en temps réel du nombre de produits amplifiés est réalisée soit à l'aide de colorants fluorescents, soit de sondes spécifiques de séquence liées à un fluorophore. Les colorants fluorescents utilisés dans ce cas peuvent se lier spécifiquement à l'ADN double brin et présenter une fluorescence uniquement lorsqu'ils sont liés à l'ADN. La fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle PCR après la synthèse du brin complémentaire. Dans le cas des sondes marquées par un fluorophore, la fluorescence se manifeste lorsque le fluorophore est clivé de la sonde lors de la synthèse du brin complémentaire. La fluorescence présentée par ces molécules est ensuite détectée par des photodétecteurs qui convertissent les signaux de fluorescence en un format lisible. La RT-PCR en temps réel nécessite une machine PCR spécialisée équipée d'un détecteur pour permettre une quantification en temps réel, car une machine PCR traditionnelle n'est pas équipée pour une telle analyse.

Le résultat peut être analysé de plusieurs manières. Une solution consiste à compter le nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence atteigne des niveaux détectables. Le cycle seuil, noté C^t, correspond au moment où la fluorescence est détectée au-delà du bruit de fond. Plus la quantité de cible dans le matériau de départ est grande, plus l’augmentation significative de la fluorescence apparaîtra rapidement, ce qui se traduira par un C^t plus faible. La valeur C^t trouve une application dans la quantification ou la détection en aval de la présence ou de l'absence de la séquence cible. De plus, comparer les valeurs C^t d’échantillons de concentration inconnue avec une série de valeurs C^t obtenues à partir d’une concentration standard peut déterminer la quantité de matrice dans une réaction inconnue. Ceci est connu sous le nom de quantification absolue et peut également être réalisé en comparant la fluorescence à une courbe standard préparée à l’aide de concentrations d’ADN connues.

La transcription inverse en temps réel et la réaction en chaîne par polymérase, ou RT-PCR en temps réel, peuvent quantifier un ARN d’intérêt au fur et à mesure de la progression de la réaction.

Pour commencer, la transcriptase inverse copie l’ARN en ADNc complémentaire. La RNase H digère l’ARN d’origine, laissant derrière elle de petites amorces attachées à l’ADNc.

Un brin complémentaire est ensuite synthétisé par l’ADN polymérase.

Une amplification ciblée peut ensuite être réalisée à l’aide de la PCR pour créer des copies exponentielles de segments spécifiques. Les deux brins sont séparés au début de chaque cycle à des températures élevées. Des amorces oligonucléotidiques complémentaires sont ensuite recuites à chaque brin d’ADNc et sont prolongées par l’ADN polymérase.

L’ADN peut être quantifié à l’aide de l’une des deux méthodes de détection différentes basées sur la fluorescence. Une méthode utilise des colorants qui ne deviennent fluorescents que lorsqu’ils sont liés à l’ADN double brin.

Le colorant se lie à l’ADN, où le brin d’origine est associé à un brin complémentaire nouvellement synthétisé. À la fin de chaque cycle de PCR, une longueur d’onde de lumière appropriée excite le colorant lié.

L’autre méthode utilise des sondes oligonucléotidiques complémentaires spécifiques à une séquence liée à un fluorophore et à une molécule d’extinction.

La réaction est continuellement exposée à une longueur d’onde de lumière appropriée, et la molécule d’extinction absorbe la fluorescence du fluorophore lorsqu’elle est proche l’une de l’autre. L’ADN polymérase détache le fluorophore pendant l’extension, empêchant ainsi l’extinction.

La méthode basée sur la sonde est spécifique, car elle ne s’attache qu’à la séquence cible. En revanche, la méthode à base de colorant n’est pas spécifique et se lie à tous les ADN double brin.

Dans les deux cas, la fluorescence émise par le fluorophore excité est détectée par des photodétecteurs qui convertissent les signaux reçus en une sortie numérique.

Le cycle de seuil, ou Ct, est le nombre de cycles de PCR pour que la fluorescence atteigne un niveau défini bien au-dessus de la fluorescence de fond.

Le cycle de seuil est inversement proportionnel à la quantité d’ARN cible dans l’échantillon initial – plus le cycle de seuil est bas, plus la quantité d’ARN d’intérêt est élevée.

La quantification absolue compare le cycle de seuil ou l’intensité de fluorescence à celle d’une courbe standard préparée à partir de concentrations d’ADN connues.

Alternativement, la quantification relative compare la fluorescence d’un échantillon à celle d’une référence. Cette méthode peut être utilisée pour comparer les changements dans l’expression des gènes dans différentes conditions.