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Avant de commencer préparer:
- Errant yhird stade drosophile larves
- HL3.1 (modification hémolymphe-like) solution de
- Plaques Sylgard dissection (caoutchouc de silicone transparent) préparés dans les petites (35 x 10 mm) des boîtes de Petri en plastique en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008) 3.
- Couper la dissection broches courtes
- Stimuler les pipettes d'électrode
- Pipettes d'enregistrement de Sharp
HL3 Solution:
- Pendant les dissections et les expériences d'électrophysiologie, de la larve sont immergés dans une solution à 2 HL3.1 qui contient (en mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 tréhalose, le saccharose 115, et 5 HEPES, pH 7,2.
- Les concentrations de CaCl 2 sont ajoutés à la solution HL3.1 pour fournir la concentration requise de Ca2 +.
- Dissections larves sont réalisées à faible teneur en Ca 2 + concentration (pour éviter la contraction musculaire) à l'aide HL3.1 + 0,25 mM de CaCl2, conservés sur la glace.
- Expériences électrophysiologiques sont généralement enregistrés dans HL3.1 + 1 mM de CaCl2, mais cela peut être ajusté de 0,4 à 1 mM de Ca 2 + au besoin.
- La solution est stérilisée par filtration HL3.1 avant utilisation, et conservés à 4 ˚ C.
Préparation de la stimulation et l'enregistrement des pipettes:
- Pipettes d'enregistrement et de stimulation sont tirés avec une Sutter P-2000 Laser micropipette extracteur base en utilisant les paramètres suivants: chaleur = 390, Filament = 4, Vitesse = 35, Delay = 200 et Pull = 0.
- Électrodes de stimulation sont préparés à partir de capillaires à paroi mince en verre borosilicate avec des extrémités larges qui ont été légèrement plus grand que la largeur de la axones moteurs coupés. Les extrémités en forme sont à Facettes pour donner une finition lisse (en utilisant une pipette Narashiga polisseuse), pour minimiser les dommages au nerf. Électrodes de stimulation sont remplis avec une solution de bain (HL3.1 + 1 mM de Ca 2 +).
- Les électrodes d'enregistrement sont préparés à partir de 1,2 mm de verre borosilicate, qui est tiré de former une pipette forte (30-60 mQ), et rempli de 3M KCl.
Partie 1: Dissection des larves de drosophile
- Troisième stade larvaire errance sont disséqués afin d'exposer les muscles de la paroi du corps, comme décrit précédemment 4.
- Les dissections sont réalisées dans HL3.1 + 0,25 mM de Ca 2 + sur des plaques de silicone de petite taille (35 x 10 mm). HL3.1 solution doit être glacée pour les dissections afin d'anesthésier la larve, et est conservé sur la glace avant et pendant les dissections.
- Les larves sont disséqués en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008), qui est modifié pour les expériences d'électrophysiologie en ajoutant 0,25 mM de Ca 2 + à la solution HL3.1 la dissection, et utilisant des goupilles de dissection courte (environ 2 mm de longueur) qui sont moins susceptible de heurter l'objectif du microscope et les électrodes lors d'une expérience.
- Après dissection, les axones moteurs de la larve sont coupés. Cela se fait en douceur la tenue de la CNS et l'élevant légèrement pour les nerfs périphériques qui innervent les muscles postérieurs au ganglion ventral peut être coupé sans endommager les muscles (figure 1). Le cerveau est alors retiré.
- La préparation des larves disséquées est lavé deux fois avec HL3.1 + 1 mM de Ca 2 +.
Figure 1. Schéma montrant les étapes de la coupe du axones moteurs de larves disséquées. Le CNS est soulevé avec des pinces et des axones moteurs sont coupés à la base du cerveau.
Partie 2: enregistrements intracellulaires de cellules musculaires larvaires.
- Placer la plaque sur le microscope de dissection d'électrophysiologie et de submerger la préparation avec HL3.1 + 1,5 mM de Ca 2 + et de fixer l'électrode de bain donc il est en contact avec la solution.
- Toutes les expériences sont réalisées sur le muscle 6 dans le troisième segment abdominal (A3). Les nerfs périphériques qui innervent les muscles sont stimulés à l'aide d'une électrode d'aspiration 5.
- Position l'électrode de stimulation dans le premier plat pour éviter les vibrations lorsque l'électrode intracellulaire est en place. Placer l'électrode de stimulation dans le voisinage proche de la motoneurones innervant les muscles 6 et appliquer l'aspiration au doux jusqu'à ce que le nerf coupé est à l'intérieur de la pipette en verre. Soyez prudent de ne pas étirer les nerfs lorsque l'aspiration est appliquée. Levez la pipette légèrement de sorte qu'il ne touche pas le muscle et la position qu'elle sorte qu'il n'est pas en tirant sur les fibres nerveuses coupées (figure 2).
Figure 2. Un schéma de la musculature et les neurones moteurs innervant d'un segment abdominal de la larve de drosophile. La position de la pipette stimulant et nerfs sectionnés et l'électrode d'enregistrement en position à six muscles sont illustrés. - Intraenregistrements cellulaires sont faites avec des microélectrodes forte remplie avec 3 M de KCl. Position de l'électrode d'enregistrement au dessus du centre de muscle 6 sur le troisième segment abdominal (A3) et régler le décalage d'entrée afin qu'il indique zéro pour la solution de bain. Abaisser lentement l'électrode et l'approche du muscle sous grossissement optique haute jusqu'à ce qu'elle touche la surface du muscle. Regardez l'oscilloscope pour confirmer que le muscle a été pénétrée. Le potentiel de repos membranaire doit être au moins à -60 mV, ou l'animal ne doit pas être utilisé. Sporadiques potentiels plaque motrice miniature doit maintenant être visible. Laisser la cellule se stabiliser pendant une minute avant de commencer à enregistrer.
- Les changements dans le potentiel de membrane sont détectés avec un stade Axon tête SH-2A 2B et un amplificateur Axoclamp et enregistré avec Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Le 2B Axoclamp est interfacée à un ordinateur qui exécute un logiciel pClamp et fonctionne en conjonction avec l'interface Digidata 1322A.
- Les cellules ont été enregistrées pendant 3 minutes sans aucun stimulus pour mesurer les réponses mEJP. Des traces ont été analysés en utilisant des logiciels d'analyse Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) et l'amplitude et la fréquence mEJP déterminée.
Stimulation du nerf:
- La fin coupé du neurone moteur est stimulé par une série d'impulsions de tension carrée (0,3 ms) à une intensité qui est suffisant pour les deux axones moteurs, pour évoquer des réponses cohérentes dans le muscle entier.
- Le stimulus est généré avec le Maître-8 générateur d'impulsions, qui est programmé pour délivrer des impulsions en permanence en fonction de la durée et des intervalles de temps.
- Prévoyez cinq secondes entre les stimuli pour la récupération synaptique à la JNM.
- Lors de la détermination de la force du stimulus, commencez par le bas niveau et d'augmenter l'intensité lentement sur plusieurs essais. L'intensité du stimulus minimum qui se traduit par une réponse évoquée doit être utilisé dans les expériences.
- Lorsque l'intensité du stimulus approprié est atteint, il devrait y avoir une EJP composé et une contraction musculaire provoquée par le stimulus.
- Marquer au moins 10 des potentiels évoqués de chaque muscle et la moyenne des amplitudes.
Partie 3: Résultats Représentant
Figure 3. Représentant enregistrement intracellulaire du muscle 6 montrant l'EJP évoqué est la réponse à une stimulation électrique du nerf segmentaire, et les potentiels sporadiques plaque motrice miniature, ou de mEJP. Amplitudes EJP dans le muscle sain 6 de type sauvage larves, comme Canton S, sont généralement autour de 40 mV et les amplitudes mEJP entre 1-3 mV.