Mesure Caenorhabditis elegans sur des milieux solides

Résumé

Dans cet article nous présentons un protocole général pour la mesure de la durée de vie des nématodes maintenu sur un support solide avec UV-tué alimentaire bactérienne.

Résumé

Le vieillissement est un processus dégénératif caractérisé par une détérioration progressive des composants cellulaires et des organites résultant de la mortalité. Le nématode

Protocole

Partie 1: Préparer la croissance des médias nématodes (NGM) plaques

Cette section décrit la préparation des plaques NGM solide pour une utilisation dans l'expérience la durée de vie. Une expérience de vie de base durée nécessite deux types de plaques: les plaques NGM standard, qui ne contiennent pas d'additifs, et Amp / FUDR plaques, qui ont à la fois à l'ampicilline (Amp) et fluorodésoxyuridine (FUDR) ajouté à l'assemblée générale nationale. L'ampicilline est utilisée pour prévenir la contamination bactérienne étrangers. FUDR inhibe la division cellulaire, réduit la production d'œufs, et empêche les oeufs d'éclore. L'utilisation de FUDR pour l'analyse de longévité n'affecte pas la durée de vie adulte et élimine la nécessité de transférer les vers tous les quelques jours afin de les séparer de la larve en croissance. Les deux types de plaques sont ensemencés avec E. coli OP50 bactéries, qui est ensuite tué par l'exposition aux UV.

1. Préparer NGM (voir section 5 pour la recette et les notes de stockage) et des boîtes de Pétri étiquette. Vous aurez besoin d'une plaque de Pétri de 60 mm par 10 mL d'NGM. Si vous commencez avec le NGM solide préalablement préparées, passez à l'étape 1.2. Si vous commencez avec le NGM fraîchement autoclavés, passez à l'étape 1.4.
2. Fondre complètement NGM solide en micro-ondes sur le haut dans 30 secondes impulsions. Swirl média entre les impulsions pour éviter les bulles de gaz sous pression de s'accumuler.
3. NGM Placez liquide dans 55 ° C ou bain d'eau sur le banc pour refroidir.
4. Une fois atteint NGM 55 ° C ajouter 33 ul de 150 mM FUDR et 100 pi de 100 mg / ml d'ampicilline par 100 mL NGM (pour Amp / FUDR plaques) et agiter pour mélanger. Pour les plaques NGM sans médicaments supplémentaires procéder directement à l'étape 1.5.
5. En utilisant une technique stérile, une pipette 10 ml NGM dans chaque assiette de 60 mm de Pétri. Eviter la formation de bulles si possible. Si des bulles se forment, ils peuvent être sauté à l'aide d'une pipette.
6. Laisser les plaques sur le banc avec des couvercles sur NGM pour permettre de solidifier et sécher. Si possible, laissez les plaques sur le banc pour 2 jours avant d'ajouter les bactéries, mais un jour ne fonctionnera que si les plaques sont nécessaires plus tôt.
7. Le jour avant que les plaques terminer le séchage, la culture LB semences liquide avec une seule colonie d'une strie frais de E. coli OP50 bactéries sur une gélose LB. Vous devez préparer au moins 1 mL d'une nuit OP50 culture par 60 plaques mm.
8. Placer OP50 culture à 37 ° C shaker et permettent aux bactéries de croître durant la nuit (la culture doit atteindre la saturation).
9. Pellet OP50 bactéries par centrifugation à 3500 g pendant 10 minutes.
10. Retirer 90% des bactéries surnageant et remettre à concentrer la culture 10x.
11. Pipeter 100 uL de 10x concentrée OP50 la culture dans le centre des assiettes NGM solidifié. Agiter doucement les plaques pour étaler la culture de bactéries, si nécessaire (idéalement bactéries devraient couvrir la zone centrale de la NGM sans venir près des murs plaque). Essayez d'éviter de toucher la pointe de la pipette sur la surface de l'assemblée générale nationale, comme des défauts dans la surface du média permettent les vers s'enfouissent dans le NGM.
12. Laisser les plaques sur le banc durant la nuit pour permettre la culture des bactéries à sécher sur la NGM solides (prend environ 24 heures).
13. Une fois sec, exposer la surface des plaques à une dose d'UV suffisante pour arrêter la croissance de la bactérie. Si vous utilisez un Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • Plaques place dans le Stratalinker et enlever les couvercles
    • Fermez la porte et tournez sur la Stratalinker
    • Appuyez sur «l'énergie»
    • Entrez '9999 'aide du clavier
    • Appuyez sur 'Démarrer'
    • Les plaques seront exposées aux UV pendant environ 5 minutes
14. Plaques avec des bactéries tuées UV peuvent être stockés à l'envers à 4 ° C pour un maximum de 1 mois.

Partie 2: Effectuer un oeuf chronométré prévoyant d'acquérir un âge synchronisé population d'animaux

Dans cette section, nous générons une population de vers de terre avec une trappe à jour commun. Ceci est accompli en permettant aux adultes reproducteurs actifs pour pondre leurs œufs sur un plateau pour une période de temps définie et permettant ces oeufs à se développer.

1. (Facultatif) Le transfert d'environ 20 vers adultes jeunes à une plaque de NGM frais sans FUDR. Laisser les plaques à 25 ° C afin de permettre à des vers pour se propager et à manger dans toute la nourriture bactérienne. Après la nourriture bactérienne a été consommé vers nouvellement éclos entrera dans le stade de croissance arrêtée Dauer. Vous allez commencer à voir la larve dauer autour d'ici une semaine, selon le nombre de vers de vous transférer à la plaque de départ. Dauer larve peut être utilisé pour les prochaines étapes pour un maximum de 1 mois.
2. (Facultatif) larve dauer transfert 20 à 30 à une plaque NGM frais sans FUDR. En présence de nourriture dauer larves deviendront des adultes reproducteurs actifs dans les 2 jours et restent reproducteurs actifs pendant quelques jours puis à 25 ° C.
3. Transfert de 10 à 15 adultes reproducteurs actifs à une plaque de NGM frais sans FUDR. Cette plaque est appelée la ponte chronométrés (TEL) la plaque.
4. Laisser la plaque TEL à 25 ° C pendant 6 heures afin de permettre à til temps de vers de terre pour pondre leurs œufs.
5. Retirer de la plaque vers adultes TEL. Plaque peut être inspecté visuellement pour les oeufs avant de retirer les adultes. Si les vers n'ont pas mis un nombre suffisant d'oeufs de la plaque TEL peut être laissé à 25 ° C jusqu'à un total de 24 heures avant d'enlever les vers adultes.
6. Placer la plaque TEL à 20 ° C jusqu'à ce que les oeufs ont éclos et les vers ont développé jusqu'au stade L4 larvaire (ce qui prend généralement deux jours pour les sauvages de type C. elegans, mais peut prendre plus de temps pour les souches de phénotypes de développement lent).

Partie 3: Les animaux score pour la durée de vie

Dans cette section, nous suivons l'âge synchronisée de la population de vers de la partie 2 jusqu'à ce qu'ils meurent. Worms sont maintenus sur Amp / FUDR plaques pour empêcher la production d'œufs et de la contamination bactérienne et sont considérés comme morts quand ils échouent à répondre aux stimuli externes.

1. Transfert L4 larve à ensemencé Amp / FUDR plaques. Pour chaque souche ou la condition d'être testé, il est typique de mettre en place les plaques 2-3 avec 25-30 vers par assiette. Images du C. étapes de la vie elegans sont fournis à titre de référence (figure 1) ^1.
2. Placez Amp / FUDR plaques à 20 ° C pendant 24 heures.
3. Après 24 heures, évaluer visuellement les vers, les médias, et les bactéries. Transfert vers de nouvelles Amp / FUDR plaques si l'un des suivants est observé:
   • Worms ont mangé la plupart de la nourriture bactérienne. Tôt dans la vie des vers de l'expérience durée devront être transférés 1 à 2 fois par semaine pour empêcher les bactéries d'être épuisées.
   • Un nombre important de larves sont présentes. C'est habituellement un signe que les vers ont été transférés aux plaques Amp / FUDR que les jeunes adultes au lieu d'L4S et ont pu poser quelques oeufs avant la FUDR a pris effet. Le FUDR sera généralement d'éviter les larves de devenir des adultes pleinement, mais parfois un peu de devenir des adultes et de se confondre avec les animaux de laboratoire.
   • Des bactéries vivantes / de croissance sont observés. Généralement, la combinaison de l'AMP et UV-tuant s'assurera qu'aucun des bactéries vivantes contaminent l'expérience, mais parfois il se produit.
   • La croissance des champignons est observée sur les médias. Si dépisté assez tôt, la croissance des champignons peuvent généralement être coupés à l'aide d'une pipette ou une spatule. Une fois qu'il pousse à être plus grand que quelques millimètres de diamètre, il est généralement plus facile de transférer les vers de terre pour une nouvelle plaque.
   • Utilisation du champ de dissection, de déterminer si chaque ver est vivant ou mort.
   • Tapoter doucement la plaque. Le ver est vivante si elle se déplace en réponse à la mise sur écoute.
   • Si le ver ne répond pas à exploiter la plaque, un zoom sur la tête de la région.
   • Tapoter doucement la tête de la vis sans fin avec le transfert de ramasser platine. Score le ver comme mort si elle ne répond pas en déplaçant sa tête.
   • Vers morts peut être retiré de la plaque.
4. Notez la date et le nombre de vers qui sont vivants et morts.
5. Retour des plaques à 20 ° C.
6. Répétez les étapes 3.3 à 3.6 tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce que tous les vers sont morts.

Partie 4: résultats représentatifs.

Les données brutes produites par une expérience de durée de vie des nématodes est une liste de dates avec chiffres correspondants de vers qui sont vivants et morts pour chaque souche testée. Le nombre de vers qui meurent chaque jour est généralement inversé pour calculer la proportion de vers vivants chaque jour (figure 2A), qui est tracée graphiquement comme une courbe de survie (figure 2B, le jour de la ponte chronométré est considéré comme jour 0 ). La durée de vie de chaque individu dans le ver de l'étude peut être calculée à partir du nombre de vers qui meurent chaque jour et utilisées pour calculer la durée de vie moyenne et la médiane pour la comparaison entre les souches. Le comptage du nombre de vers vivants chaque jour n'est pas utilisé directement dans l'analyse de la durée de vie. Worms maintenu sur un support solide sera l'occasion «fuir», ou ramper soit sur le mur de la plaque ou vers le bas sous le support. Le nombre de vers vivants chaque jour peut être utilisée pour déterminer combien les vers fui pendant toute la durée de l'expérience. Worms qui fuient sont généralement retirés de l'analyse. Comme point de repère, la durée de vie typique médiane de N2, le C. elegans souche de type sauvage, maintenue sur le rayonnement UV-tué les bactéries à 20 ° C est d'environ 25 jours, mesurée à partir d'oeufs.

Partie 5: Solutions

Croissance nématode médias (NGM), 100 ml:
Combiner:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Peptone
2 g	Agar
Autoclave pendant 40 minutes et laisser refroidir à 55 ° C, puis ajouter:
100 uL	1 M MgSO 4
100 uL	5 mg / ml de cholestérol
100 uL	1 M de CaCl2
1,625 ml	1,5 M pH 6,0 KPi
NGM liquide peut être utilisé immédiatement pour verser des plaques ou des permis de solidifier et stockées à long terme à la température ambiante

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	Bactotryptone
5 g	Extrait de levure
10 g	NaCl
10 ml	Tris 1 M pH 8,0
1 L	l'eau déminéralisée
Autoclave et conserver à température ambiante.

1 M MgSO 4, 300 ml:
73,95 g	MgSO 4
300 ml	l'eau déminéralisée
Autoclave et conserver à température ambiante.

5 mg / ml de cholestérol, 200 ml:
1 g	le cholestérol
200 ml	100% d'éthanol
Filtre stériliser et stocker à température ambiante.

1 M de CaCl 2, 500 ml:
27,75 g	CaCl 2
500 ml	l'eau déminéralisée
Filtre stériliser et stocker à température ambiante.

1,5 M pH 6,0 KPi, 1L:
Combiner:
31,4 g	KPi dibasique
179,6 g	KPi monobasique
850 ml	l'eau déminéralisée
Chauffer tout en mélangeant afin de permettre KPi de dissoudre dans la solution. Ajuster le pH à 6,0 avec NaOH 10 N.
Ajouter de l'eau déminéralisée à 1 L.
Autoclave et conserver à température ambiante.

Tris 1 M, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 ml	l'eau déminéralisée
Ajuster le pH à 8,0 avec HCl.
Ajouter de l'eau déminéralisée à 500 mL.
Filtre stériliser et stocker à température ambiante.

150 mM fluorodésoxyuridine (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 ml	l'eau stérile déionisée
Conserver à -20 ° C.

100 mg / ml d'ampicilline (Amp), 10 ml:
1 g	Ampicilline
10 ml	l'eau stérile déionisée
Conserver à -20 ° C.

50 mg / ml de carbénicilline (Carb), 10 ml:
500 mg	Carbénicilline
10 ml	l'eau stérile déionisée
Conserver à -20 ° C.

1 M isopropylique β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:
2,38 g	IPTG
10 ml	l'eau stérile déionisée
Conserver à -20 ° C.

Images Figure 1. Fond clair de C. étapes de la vie elegans, y compris les œufs, les quatre stades larvaires (L1 - L4), et l'adulte. Tous les panneaux montrent les hermaphrodites, sauf le coin inférieur droit, qui montre un mâle adulte (Image tirée du bois (1988)).

Les résultats représentatifs Figure 2. À partir d'un C. expérimentation elegans durée de vie comparant sauvages N2 souche de type à une souche contenant une mutation dans le gène daf-2. (A) Un tableau présentant les données recueillies, y compris nombre de jours depuis les vers étaient des œufs, du nombre de vers morts observées chaque jour, et le pourcentage de l'échantillon initial restant en vie à chaque jour (tel que calculé à partir des chiffres quotidiens de vers morts) . (B) courbes de survie correspondant à la durée de vie des données fournies dans (A).

Figure 3. Comparaison Représentant de lipofuscine entre les adultes jeunes et vieux C. elegans. Images en champ clair apparaissent sur les images gauche et canal de fluorescence DAPI sur la droite. Panneaux du haut montrent un ver de 4 jours et les panneaux du bas montrent un ver 11 jours anciens (tel que mesuré à partir d'œufs).

Discussion

Le contrôle génétique de la longévité a été largement étudié en C. elegans, largement dû à la facilité et la rapidité avec laquelle la durée de vie peut être déterminée. Le protocole abordées dans cet article décrit un cadre de base pour obtenir des données reproductibles durée de vie en C. elegans et peut également être appliquée à des espèces relatednematode. ² En faisant quelques simples modifications de ces procédures peuvent être adaptés pour mesurer la durée de vie sous une variété de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agar-agar	Réactif	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicilline	Réactif	MidSci	0339
BactoTryptone	Réactif	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Réactif	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Réactif	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbénicilline	Réactif	Biotechnologie de l’or	C0109
Cholestérol	Réactif	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodéoxyuridine (FUDR)	Réactif	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropyle β ;-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Réactif	Biotechnologie de l’or	I2481C5
KPi Dibasic	Réactif	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Réactif	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Réactif	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Réactif	Fisher Scientific	S251
Tris	Réactif	Sigma-Aldrich	T1503
Extrait de levure	Réactif	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)