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Article de méthode

Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray

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DOI :

10.3791/1182

⸱

20 mars 2009

 ,  ,  , 
1Warnell School of Forestry and Natural Resources, University of Georgia (UGA), 2Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Instituto Tecnologia Química e Biológica UNL, Av. da República

Dans cet article

Résumé

L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda, P. taeda, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.

Résumé

PtGen2 est une puce 26496 fonction d'ADNc contenant amplifié ESTs pin blanc. Le tableau est produit dans notre laboratoire pour une utilisation par les chercheurs qui étudient l'expression des gènes dans les espèces de conifères et d'autres pins. PtGen2 a été élaboré à la suite de nos efforts de découverte de gènes chez le pin taeda, et est composé de séquences identifiées principalement par les tissus des racines, mais aussi de l'aiguille et la tige. PtGen2 1,2 a été testé par hybridation différents Cy-dye étiquetés ADNc cible de conifères , utilisant à la fois amplifié et non amplifié méthodes indirectes d'étiquetage, et aussi testé avec un certain nombre de conditions d'hybridation et de lavage. Cette vidéo se concentre sur la manipulation et le traitement des diapositives avant et après pré-hybridation, ainsi que, après hybridation, en utilisant certaines modifications aux procédures développées précédemment. Sont également inclus 3,4, sous forme de texte uniquement, sont les protocoles utilisés pour la production, l'étiquetage et le nettoyage des s ADNc cible, ainsi que des informations sur le logiciel utilisé pour le traitement des données en aval.

PtGen2 est imprimé avec un tampon d'impression exclusive qui contient de fortes concentrations de sel qui peut être difficile à enlever complètement. Les lames sont d'abord lavé dans une solution tiède de SDS avant de pré-hybridation. Après pré-hybridation, les lames sont lavées vigoureusement dans plusieurs changements d'eau pour l'élimination complète des sels restants. LifterSlips ™ sont ensuite nettoyées et positionnés sur les lames et les ADNc marqué est soigneusement chargée sur la puce par voie d'action capillaire qui prévoit une répartition uniforme de l'échantillon à travers la lame, et réduit le risque de constitution de bulles. L'hybridation des cibles pour le tableau est fait à 48 ° C dans des conditions de forte humidité. Après l'hybridation, une série de lavages standards sont effectuées à 53 ° C et la température ambiante pendant des périodes prolongées. Traitement PtGen2 diapositives en utilisant cette technique réduit le sel et le SDS dérivés artefacts souvent vu lorsque le tableau est traité moins rigoureusement. Hybridation des cibles à partir de plusieurs sources différentes ARN conifères, ce protocole de traitement donné moins d'artefacts, de fond réduit, et a fourni une meilleure cohérence entre les différents groupes expérimentaux de tableaux.

Protocole

(Remarque Sections 1 - 4 Non démontrée dans la vidéo)

Préparation Cy-Étiqueté cible d'ADNc

Ce qui suit est le protocole que nous utilisons pour la synthèse d'ADNc à partir d'ARN total de pins taeda et indirects étiquetage ADNc avant biopuces hybridations. Bien que quelques non-triviales modifications ont été apportées, le protocole ci-dessous est similaire à celle dans le manuel d'instructions fourni avec le kit Invitrogen SuperScript marquage indirect d'ADNc.

Partie 1: premier brin réaction de synthèse d'ADNc

  1. Mélanger et Centrifuger brièvement chaque composante kit avant utilisation.
  2. Préparer des réactions comme suit:
    • Xμl DEPC-H 2 O
    • Xμl ARN total, 20 ug / réaction (prétraitées avec de la DNase Turbo Ambion a)
    • Ancré 2μl Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
    • 1 microlitre Primer hexamères aléatoires
    • Volume total = 18μl
  3. Incuber les tubes à 70 ° C pendant 5 minutes, puis placer sur la glace pendant 1-2 minutes.
  4. Ajoutez le code suivant à chaque tube de réaction sur la glace:
    • 6μl 5X premier brin de tampon
    • 1.5μl DTT 0,1 M
    • 1.5μl mélange dNTP 10 mM
    • 1 microlitre RNaseOUT (40U/μl)
    • 2μl SuperScript III RT (400U/μl)
  5. Mélanger doucement et centrifuger brièvement. Incuber le tube pendant la nuit à 45 ° C.
  6. Ajouter 15μl de NaOH 1M dans chaque tube de réaction et bien mélanger.
  7. Incuber le tube à 70 ° C pendant 10 minutes.
  8. Ajouter 15μl d'HCl 1M, mélanger délicatement.
  9. Ajouter l'acétate de sodium 3M 20 pi (pH 5,2), mélanger délicatement.

Partie 2: Purifiant premier brin d'ADNc.

  1. Ajouter 500μl de tampon de chargement à l'ADNc (de l'étape 1.9) et bien mélanger.
  2. Placer une colonne de purification SNAP (fourni avec le kit de marquage indirect) sur un tube de collecte et de charger votre ADNc sur la colonne.
  3. Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives.
  4. Placer la colonne sur le tube de SNAP même collection et ajouter 500μl de tampon de lavage.
  5. Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives.
  6. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 à trois reprises, pour un total de trois lavages 500μl.
  7. Spin une fois de plus à 14000 g à température ambiante pendant 1 sec minute; jeter le accréditives.
  8. Placer la colonne sur un tube SNAP nouvelle 1.5ml.
  9. Ajouter 50 pl de DEPC-eau tiède (50 ° C) à la colonne et la colonne SNAP incuber à température ambiante pendant 1 minute. Éluer l'ADNc via un spin à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute.
  10. Répétez l'étape 2.9, en utilisant 100 pi de chaudes DEPC-eau et le même tube de 1.5ml pour l'éluant.
  11. Ajouter 20 pi d'acétate de sodium 3M (pH 5,2) à l'éluant à partir des étapes 2.9 et 2.10.
  12. Ajouter 3μl de glycogène (20mg/ml) dans le tube et mélanger.
  13. Ajouter 500μl d'glacée EtOH à 100%, bien mélanger et incuber le tube pendant 1 heure à -80 ° C.
  14. Spin le tube à 14000 g à 4 ° C pendant 20 minutes. Retirer délicatement le surnageant.
  15. Ajouter 500μl d'glacée EtOH à 70% et de spin le tube à 14000 g à 4 ° C pendant 5 minutes. Retirer délicatement le surnageant.
  16. Sécher à l'air de l'échantillon pendant 5 minutes; s'assurer que tous les EtOH est enlevé.
  17. Chauffer le tampon de couplage 2X à 37 ° C pendant 5 minutes et re-suspension de l'échantillon d'ADNc dans 5uL de tampon de couplage chaleur 2X.
  18. Chauffer l'ADNc / Tampon de couplage à 50 ° C pendant 10 minutes et tourbillon bien. Assurez-vous que votre culot d'ADNc est totalement remis en suspension dans le tampon de couplage 2X.

Partie 3: Étiquetage par un colorant fluorescent

Lors de la préparation de la réaction, être prudent afin de minimiser l'exposition de la solution de colorant à la lumière. En outre, le DMSO est hygroscopique et absorbe l'humidité de l'air, qui va réagir avec l'ester NHS de la teinture et de réduire considérablement le rendement de la réaction de couplage. Gardez le DMSO fourni dans le kit dans un bouchon à vis ambrée flacon à -20 ° C, et laisser le flacon à température ambiante avant d'ouvrir pour éviter la condensation. Utilisez uniquement le DMSO fourni avec ce kit.

  1. Ouvrez un paquet de Cy-3 ou Cy-5 Dye et ajouter 75μl de DMSO directement au flacon de teinture.
  2. Ajouter 5uL de la solution de DMSO / colorant pour le tube de l'étape 2.18.
  3. Bien mélanger et incuber le tube à température ambiante dans l'obscurité pendant 1 heure.
  4. Ajouter 20 pi d'acétate de sodium 3M (pH 5,2) à la solution de teinture couplé ADNc.
  5. Ajouter 500μl de tampon de chargement à la solution d'ADNc. Mélangez bien au vortex.
  6. Placer une colonne SNAP sur un tube de collecte clair et la charge de la solution d'ADNc / tampon.
  7. Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives.
  8. Placer la colonne SNAP sur la même collectionle tube, ajouter 500μl de tampon de lavage de la colonne.
  9. Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives.
  10. Répétez les étapes 3. 8 à 3,9 à trois reprises, pour un total de trois lavages 500μl.
  11. Spin une fois de plus à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute; jeter le accréditives.
  12. Placer la colonne sur un tube SNAP ambrée nouvelle collection.
  13. Ajouter 65μl de DEPC-eau tiède (50 ° C) à la colonne SNAP et incuber à température ambiante pendant 1 minute.
  14. Centrifuger à 14000 g à température ambiante pendant 1 minute et recueillir le flux continu. Le flux continu doit contenir 60μl de votre purifiée colorant couplé ADNc.

Partie 4: Évaluation de la procédure de labellisation.

  1. Effectuer un essai de spectrophotomètre pour évaluer chacun étiquetage Cy-ADNc. Calculer le nombre total de pmoles d'ADNc synthétisé: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calculez le total de pmoles incorporées Cy-Dye pour chaque réaction de marquage: pmol Cy3 = [DO 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [DO 650 X vol.] / 0,25. Ensuite, calculez le pmol de nucléotides / pmol ratio de teinture pour chaque réaction. Optimal réactions génèrent 6000pmol> d'ADNc (par 60ul),> 200pmol de Cy-Dye (par 60ul), et un ratio de nucléotides / colorant qui est <30.

Partie 5: Glissez prélavage

  1. Le tableau est imprimé sur PtGen2 diapositives UltraGAPS Corning (amino-silane couché) et les ADNc sont UV-réticulé. Imprimer taches sont clairement visibles en raison de la forte teneur en sel du tampon.
  2. Utilisez un stylo à pointe de diamant pour marquer le toboggan pour les zones supérieure et inférieure de la zone d'impression (en option).
  3. Mettez environ 250mL pré-chauffé à 43 ° C une solution à 0,2% de SDS dans un plat à laver microscope à glissière (3 "x 4").
  4. Placer les lames d'être pré-hybridés dans le rack glisser et plonger dans la solution de SDS 15-20 fois très vigoureusement pour éliminer les sels sur les diapositives.
  5. En utilisant une pince, retirer soigneusement les diapositives de la grille et les placer dans un bocal contenant de Coplin mémoire tampon de pré-hybridation (5X SSC, 0,1% SDS, 1% de BSA) qui a été préchauffé à 43 ° C. Incuber à 43 ° C pendant au moins une heure.

Partie 6: pré-hybridation

  1. Mettre en place cinq plats glisser à laver, chacun rempli de millipure dH 2 O, et une jarre de Coplin remplie moléculaires isopropanol de qualité. Placer les lames dans un rack de diapositives et processus de façon séquentielle à travers cinq plats par tremper 20 fois chacun.
  2. Retirer diapositives deux à la fois de l'eau de lavage cinquième et DIP 5-6 fois à la place de l'isopropanol et immédiatement se glisse dans la microcentrifugeuse diapositives (paillasse Chipmate, 2 postes) et de spin 1 minute à sécher.
  3. Diapositives Nettoyer à l'air comprimé filtré à travers un filtre à cartouche de 0,22 um et placez-les avec le code barre vers le haut dans une chambre d'hybridation génomique Solutions.
  4. LifterSlips Clean ™ avec air filtré et les positionner sur les lames avec les bandes blanches vers le bas. Utiliser un embout de pipette jaune pour aligner les délicatement glisser lifter sur la diapositive (lavage LifterSlips ™ abord dans l'éthanol à 70% est facultative. Nous avons trouvé que c'était inutile.)

Partie 7: Hybridation

Doit être effectuée à la lumière sombre ou faible.

  1. Pour chaque lame à hybrider, calculer le montant de Cy-5 et Cy-3 ADNc marqué pour donner 50-75pmol de chaque cible. Combinez ces montants dans un seul tube et sécher dans un dessiccateur à vide avec le réglage de la chaleur à 37-45 ° C. Évitez de faire sécher complètement!
  2. Resuspendre les sondes séché dans 60mL de tampon d'hybridation (fait frais ce jour-là) et brièvement au vortex.
  3. Incuber les ADNc resuspendu pendant 5 minutes dans un bain de 95 ° C puis centrifuger rapidement pendant 30 secondes.
  4. Chargez le volume de sonde toute suspension par pipetage lentement à la diapositive-LifterSlip ™ de jonction au fond (fin du code à barres) de la diapositive. La diapositive se charge par voie d'action capillaire. (Certains préfèrent pipette sur la diapositive et puis doucement superposer les LifterSlip ™ s'agit d'une méthode d'un seul coup, car si vous obtenez les bulles vous ne pouvez pas déplacer le ™ LifterSlip après le placement qui peut conduire à repérer les artefacts bavures)
  5. 20ul place de la TNT 100 mM dans chacun d'humidité bien situés aux extrémités de la chambre.
  6. Placez le haut de la chambre et serrer les vis à came. Couvrir la chambre avec du papier aluminium et les plonger dans un bain d'eau de 48 ° C pendant 12-18 heures avec une agitation douce à 50-60 min.

Partie 8: Post-hybridation Lave

Tous les lavages doivent être effectués à la lumière sombre ou faible. Les lames doivent jamais être autorisés à sécher jusqu'à l'étape finale.

  1. Mettre en place un pot rempli de Coplin solution de lavage n ° 1 @ 53 ° C, et quatre plats glisser-linge rempli de 250 ml de chacun des éléments suivants: 1) WSolution n ° 1 de cendres @ 53 ° C, 2) la solution de lavage n ° 2 @ température ambiante, 3 & 4), deux plats contenant la solution de lavage # 3 @ température ambiante.
  2. Retirez délicatement les diapositives de la chambre d'hybridation et placez-les deux à la fois dans la jarre de Coplin. Laisser reposer pendant 30 secondes, puis soulevez le glisser lentement et le bordereau de lifter restera dans le bocal. Placer les lames dans le châssis lame et immédiatement plonger dans la solution de lavage n ° 1 (1X SSC, SDS 0,2%, préchauffer à 43 ° C). Répétez jusqu'à ce que tous LifterSlips sont enlevés et toutes les diapositives doivent être lavés sont dans la solution de lavage n ° 1 plat. Plongez en rack de haut en bas 10 fois vigoureusement.
  3. Vaisselle Placer dans 53 ° C dans l'air shaker avec secousses à 50-100 rpm pendant 10 minutes.
  4. Transfert rack pour laver Solution n ° 2 (0,1 X SSC, SDS 0,2%), plongent 10 fois, et incuber à température ambiante, lent agitant pendant 10 minutes.
  5. Plongez en rack 15 fois dans la solution de lavage première # 3 (0,1 X SSC) pour enlever tout résidu SDS effectuer le relais de la solution de lavage n ° 2. Placer la grille dans la solution de lavage n ° 3 secondes plat, plongent 10 fois, puis lente secouer pendant 10 minutes.
  6. Placer les lames dans des tubes Falcon 50 ml et de spin plafonné @ 1500 rpm dans la centrifugeuse équipée d'un rotor swing. Retirer diapositives à la lumière de conteneurs épreuve, nous utilisons un autre tube Falcon recouvert de papier d'aluminium, et purger l'air du tube avec de l'azote, bonnet serré (ce qui réduit l'oxydation des colorants Cy, Cy-5 en particulier en été lorsque les niveaux d'ozone sont plus élevés ). Les diapositives peuvent être stockées pendant quelques heures avant la numérisation dans les tubes purgées à l'azote, mais les meilleurs résultats sont obtenus lorsque le signal de balayage est effectué immédiatement après le lavage.

Partie 9: Collecte des données et analyse statistique

  1. Données d'image Scan est recueilli sur un ScanArray PerkinElmer. Nous utilisons un paramètre de numérisation de 10 microns et l'équilibre Cy3 et Cy5 signaux utilisant la méthode d'ajustement de ligne selon les instructions du fabricant.
  2. Fichiers TIF sont maillées et des données signal brut collecté et filtré avec ImaGene version 7.5 (BioDiscovery, Inc, El Segundo, Californie)
  3. Normalisation des données et d'évaluation afin de déterminer statistiquement espèces valides exprimés différentiellement est fait avec des outils de tableau BRB Ver. 3.7.
  4. Pattern Analysis pour faciliter la détermination des gènes exprimés de façon coordonnée se fait avec l'expression des gènes Pattern Analysis Software (GEPAS) Ver. 3.1.

figure-protocol-1

Figure 1. Exemple de gamme PtGen2 traitées à l'aide de cette l. Protoco

figure-protocol-2

Figure 2. Exemple de gamme PtGen2 traitées en utilisant l'hybridation et des protocoles standards à laver.

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Discussion

PtGen2 a été récemment développée, microréseaux d'ADNc personnalisée qui a été conçu pour être utilisé principalement par la communauté de recherche à encens de pin. Les résultats préliminaires généré à ce jour ont montré que le tableau à être un outil précieux dans l'évaluation des événements transcriptionnels qui se produisent en réponse à la sécheresse, ainsi que dans la surveillance des changements qui surviennent au cours du développement embryonnaire dans le pin maritime, pin maritime, nous avons ...

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Remerciements

L'étiquetage, l'hybridation et protocoles de lavage ici contiennent des modifications à celles développées antérieurement par le Dr J. Quackenbush tout à l'Institute for Genomic Research (TIGR), le Dr Shawn Levy à la ressource partagée Microarray Vanderbilt (VMSR), et le Dr Rob Alba alors à l'Institut Boyce Thompson, (RTC) Université Cornell.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon de pré-hybridationTampon5X SSC, 0,1 % SDS, 1 % BSA
Tampon d'hybridationTampon30 % de formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, ARN PolyA à 1 % (Invitrogen, POLYA.GF), SDS à 0,1 %
Solution de lavage n°1Tampon1X SSC, 0,2 % SDS, préchauffer à 43 °C°C
Solution de lavage n°2Tampon0,1X SSC, 0,2 % SDS
Solution de lavage n°3Tampon0,1X SSC
Alcool isopropyliqueRéactifSigma-Aldrich34959-2,5 L
Tubes coniques de 50 mLAutreFalcon BD352070
Tubes coniques de 15 mLAutreFalcon BD352196Utiliser ce bouchon ou un bouchon similaire placé au fond de chaque tube conique de 50 ml pendant la centrifugation
Bocal de CoplinWheaton900520
Plaque de coloration &et support AutreWheaton900200
Albumine de sérum bovin (BSA)AutreSigma-AldrichA-9418
ARN polyAInvitrogenPOLYA.GF
Marquage indirect d'ADNc SuperScriptMC KitInvitrogenL1014-02
Turbo DNaseKitAmbionAM1907
Système
Colorant Cy-5RéactifGE HealthcarePA25001
Colorant Cy-3RéactifGE HealthcarePA23001
LifterSlips™AutreErie Scientific25X601
HybChambersÉquipementGeneMachinesJHYB200003

Références

  1. Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
  2. Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
  3. Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
  4. Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
  5. Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
  6. Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).

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