Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray

Summary

L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda, P. taeda, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.

Abstract

PtGen2 est une puce 26496 fonction d'ADNc contenant amplifié ESTs pin blanc. Le tableau est produit dans notre laboratoire pour une utilisation par les chercheurs qui étudient l'expression des gènes dans les espèces de conifères et d'autres pins. PtGen2 a été élaboré à la suite de nos efforts de découverte de gènes chez le pin taeda, et est composé de séquences identifiées principalement par les tissus des racines, mais aussi de l'aiguille et la tige. PtGen2 ^1,2 a été testé par hybridation différents Cy-dye étiquetés ADNc cible de conifères , utilisant à la fois amplifié et non amplifié méthodes indirectes d'étiquetage, et aussi testé avec un certain nombre de conditions d'hybridation et de lavage. Cette vidéo se concentre sur la manipulation et le traitement des diapositives avant et après pré-hybridation, ainsi que, après hybridation, en utilisant certaines modifications aux procédures développées précédemment. Sont également inclus ^3,4, sous forme de texte uniquement, sont les protocoles utilisés pour la production, l'étiquetage et le nettoyage des s ADNc cible, ainsi que des informations sur le logiciel utilisé pour le traitement des données en aval.

PtGen2 est imprimé avec un tampon d'impression exclusive qui contient de fortes concentrations de sel qui peut être difficile à enlever complètement. Les lames sont d'abord lavé dans une solution tiède de SDS avant de pré-hybridation. Après pré-hybridation, les lames sont lavées vigoureusement dans plusieurs changements d'eau pour l'élimination complète des sels restants. LifterSlips ™ sont ensuite nettoyées et positionnés sur les lames et les ADNc marqué est soigneusement chargée sur la puce par voie d'action capillaire qui prévoit une répartition uniforme de l'échantillon à travers la lame, et réduit le risque de constitution de bulles. L'hybridation des cibles pour le tableau est fait à 48 ° C dans des conditions de forte humidité. Après l'hybridation, une série de lavages standards sont effectuées à 53 ° C et la température ambiante pendant des périodes prolongées. Traitement PtGen2 diapositives en utilisant cette technique réduit le sel et le SDS dérivés artefacts souvent vu lorsque le tableau est traité moins rigoureusement. Hybridation des cibles à partir de plusieurs sources différentes ARN conifères, ce protocole de traitement donné moins d'artefacts, de fond réduit, et a fourni une meilleure cohérence entre les différents groupes expérimentaux de tableaux.

Protocol

(Remarque Sections 1 - 4 Non démontrée dans la vidéo)

Préparation Cy-Étiqueté cible d'ADNc

Ce qui suit est le protocole que nous utilisons pour la synthèse d'ADNc à partir d'ARN total de pins taeda et indirects étiquetage ADNc avant biopuces hybridations. Bien que quelques non-triviales modifications ont été apportées, le protocole ci-dessous est similaire à celle dans le manuel d'instructions fourni avec le kit Invitrogen SuperScript marquage indirect d'ADNc.

Partie 1: premier brin réaction de synthèse d'ADNc

1. Mélanger et Centrifuger brièvement chaque composante kit avant ....

Discussion

PtGen2 a été récemment développée, microréseaux d'ADNc personnalisée qui a été conçu pour être utilisé principalement par la communauté de recherche à encens de pin. Les résultats préliminaires généré à ce jour ont montré que le tableau à être un outil précieux dans l'évaluation des événements transcriptionnels qui se produisent en réponse à la sécheresse, ainsi que dans la surveillance des changements qui surviennent au cours du développement embryonnaire dans le pin maritime, pin maritime, nous avons .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampon			tampon de pré-hybridation	5X SSC, 0,1 % SDS, 1 % BSA
Tampon			d’hybridation	30 % formamide, 5X SSC, 5X Denhardt' , 1 % d’ARN PolyA (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1 % SDS
Wash Solution #1	Buffer			1X SSC, 0,2 % SDS, préchauffer à 43° ;
C Wash Solution #2	Buffer			0.1X SSC, 0.2 % SDS
Wash Solution #3	Buffer			0.1X SSC
Réactif d’alcool isopropylique		Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Tubes coniques	Autre	Falcon BD	352070
15mL Tubes coniques	Autre	Falcon BD	352196	Utilisez ce capuchon ou un capuchon similaire placé au fond de chaque tube conique de 50 ml pendant la centrifugation
Coplin Jar		Wheaton	900520
Staining Dish & Rack	Autre	Wheaton	900200
Albumine de sérum bovin (BSA)	Autre	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA ARN		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM Kit de marquage indirect de l’ADNc		Invitrogen	L1014-02
Turbo	Kit DNase	Système Ambion	AM1907
Réactif
colorant Cy-5		Healthcare	PA25001
Réactif de colorant Cy-3		GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™ ;	Autres	Erie Scientific	25X601
HybChambers		GeneMachines	JHYB200003