La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Résumé

Une méthode simple, peu coûteux et efficace de préparer les embryons de drosophile pour live-imagerie analyse est présentée. Notre protocole prévoit l'échange d'humidité et de gaz et ne compresse pas l'embryon de drosophile. Cette méthode est adaptée pour la GFP imagerie basée sur des embryons de drosophile direct en utilisant un stéréomicroscope ou microscope composé debout.

Résumé

Protéine fluorescente verte (GFP) basé timelapse vivons-imagerie est une technique puissante pour étudier la régulation génétique de processus dynamiques tels que la morphogenèse des tissus, adhérence cellule-cellule, ou la mort cellulaire. Embryons de drosophile exprimant la GFP sont facilement imagée en utilisant la microscopie soit stéréoscopique ou confocale. Un but de tout protocole vivons-imagerie est de minimiser les effets néfastes tels que la déshydratation et l'hypoxie. Protocoles antérieurs pour préparer des embryons de drosophile pour live-analyse de l'imagerie ont impliqué plaçant embryons dechorionated dans l'huile d'halocarbures et de les intercaler entre un halocarbure perméables au gaz de membrane et une lamelle

Protocole

Préparation

1. Recueillir des embryons sur le standard des plaques d'agar jus de raisin ^4. Il est commode d'utiliser un système automatisé de drosophile Egg Collector (flymax scientifique Equipment Ltd.) Utiliser synchrones en scène des collections embryon réduire le nombre de dechorionations qui doivent être effectuées afin d'obtenir un nombre suffisant d'embryons au stade désiré de développement.
2. Préparer une diapositive dechorionation en attachant un morceau de scotch double-face à une lame de microscope, retirer la pellicule protectrice de la bande.
3. Préparer la chambre de l'imagerie en direct par couper un morceau de tissu pour tenir dans le puits de la chambre. Placez le tissu dans le puits et le mouillé avec de l'eau distillée.
4. Mélanger l'huile d'halocarbures (Halocarbon Products Corp) de la série 700 et série 56 de viscosité à un ratio de 1:1. Le mélange peut être stocké et utilisé indéfiniment.
5. Placez plusieurs petites gouttes d'huile d'halocarbures sur la surface d'une lamelle (22 x 40 mm, n ° 2). Le volume n'est pas critique mais doit être de l'ordre de ul 20-40.

Procédure

1. Avec l'aide d'un stéréomicroscope, recueillir des embryons à partir du raisin Jus-agar en utilisant soit une paire de pinces de bijoutier (n ° 5) ou d'un pinceau très fin. Les embryons ont tendance à coller les unes aux autres et à des conseils de la pince », ils sont facilement collectées en touffes.
2. Avec l'aide d'un stéréomicroscope, abaissez doucement la touffes d'embryons qui ont adhéré à la pointe de la pince sur la surface de la bande sur la diapositive dechorionation.
3. En utilisant à nouveau le stéréomicroscope, doucement pousser ou un AVC que les embryons avec le côté de la pince, afin de casser la chorion externe cireuse sans rupture de la membrane interne vitelline (l'embryon va éclater, si la membrane vitelline est rompue).
4. Une fois le chorion externe a été rompue, taquiner l'embryon à partir du chorion, l'embryon dechorionated tend à adhérer à la surface de la pince. Prenez soin d'éviter de toucher l'embryon dechorionated à la surface de la bande.
5. Dès que l'embryon n'est dechorionated, rapidement, il transfert à la baisse précédemment préparé de l'huile d'halocarbures sur la lamelle. Toucher la pointe de la pince transportant l'embryon dechorionated à la surface de la goutte d'huile sur les halocarbures - ce déloge l'embryon de la pince dans l'huile.
6. Confirmer le transfert de l'embryon à la goutte d'huile. Cela peut être fait à l'œil nu à condition que vous travaillez sur un fond noir et d'utiliser une source d'illumination par fibre optique fixé à un angle oblique.
7. Avant de tenter de dechorionate autre embryon, nettoyer toute l'huile de la pince. Pince enduit d'huile ont moins d'achat sur la surface du chorion, ce qui rend plus difficile dechorionation.
8. Embryons sont porteurs Dechorionated dans l'huile d'halocarbures. En utilisant une pince ou d'un pinceau et tout en regardant à travers une loupe binoculaire, poussez l'embryon au fond de la goutte d'huile et l'organiser dans la position désirée.
9. Vite inverser la lamelle sur le bien de la chambre de l'imagerie en direct. Confirmez que les embryons sont au repos contre la lamelle dans l'orientation désirée. En raison de leur flottabilité dans l'huile, les embryons seront désormais flotter contre la surface inférieure de la lamelle. Fixer la lamelle de la chambre de l'imagerie en direct avec du ruban adhésif. Aérer la chambre par des trous dans la bande dans la zone où la bande enjambe le fossé entre la fin de la lamelle et la fin du puits de la chambre de l'imagerie en direct.
10. Un microscope à fluorescence verticale ou un stéréomicroscope à fluorescence peut maintenant être utilisé à l'image de l'embryon.

Discussion

Nous décrivons une nouvelle méthode de préparation des embryons de drosophile pour l'analyse de l'imagerie en direct, que nous appelons le protocole goutte suspendue. Malheureusement, il n'est pas possible d'utiliser le protocole goutte suspendue si l'on travaille avec un microscope inversé. Dans ce cas, la technique sandwich (comme décrit ci-dessus dans le résumé) doivent être utilisées et la compression des embryons reste un sujet de préoccupation.

Dans les expériences ...

Matériaux

L'équipement standard et les matériaux nécessaires à la préparation des embryons pour vivre d'imagerie utilisant le protocole goutte suspendue comprennent les éléments suivants: des lames de microscope, lamelles (22 x 40 mm, n ° 2), ruban adhésif double face, des pinces de bijoutier (style Dumont n ° 5 ), huile d'halocarbures série 56 et série 700 (Halocarbon Products Corp), un couteau ou une lame de rasoir seule pointe, papier de soie, des ciseaux, de l'eau distillée, ruban à usage général, et une pipette apte à délivrer ul 20-40. Le protocole d'imagerie vivons exige également une chambre de sur-mesure imagerie en temps réel. Il est préparé par une réduction de 5 mm en polycarbonate pense feuille de plastique pour les dimensions d'une lame de microscope standard (75 x 25 mm) et en utilisant un rotor pour créer une dépression profonde 3mm dans la glissière (20 X 55 mm). L'accès à un stéréomicroscope (loupe binoculaire) et une source d'illumination par fibre optique est également requise.