Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Résumé

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Résumé

Whole montage

Protocole

1. FIXATION

1. Fix embryons nuit à 4 ° C avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS.
2. Retirer fixage et de lavage 2 x PBS, 5 minutes chacun à la température ambiante (RT).
3. Embryons manuellement dechorionate en PBS dans une plaque de verre de dépression en utilisant une pince horloger. Après dechorionation, les embryons sont transférés à l'aide d'un incendie poli pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène.
4. Transfert des embryons à travers une série de 25%, 50% et 75% de méthanol dans du PBS pendant 5 minutes chacune.
5. Remplacer liquide avec du méthanol à 100%, incuber 5 minutes,....

Discussion

Le protocole présenté ici fonctionne bien avec des sondes qui donnent un signal propre forte après coloration pendant 30-45 minutes dans une phosphatase alcaline médiée typiques de réaction. Avant de procéder à l'fluorescente protocole d'hybridation in situ, nous examinons toujours nos sondes en utilisant la norme non fluorescent protocole (fourni dans le matériel supplémentaire avec le protocole de synthèse de la sonde). Nous avons eu moins de succès avec les fluorescents protocole d'hybridation in situ en .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de paraformaldéhyde à 16 %, qualité EM	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluer à 4 % dans du PBS 1,33x (concentration finale 1x). Conserver en aliquots de 2 ml à –20°C
Protéinase K, grade PCR recombinante	Roche Group	03115879001	Préparer une solution mère à 20 mg/ml dans de l’eau. Conserver en aliquots de 1 ml à –20°C
Réactif de blocage	Roche Group	11096176001	Préparer une solution mère à 10 % dans un tampon acide malique 1x. Conserver en aliquots de 50 ml à –20°C. Stable au cours de plusieurs cycles de congélation/décongélation.
Anti-fluorescéine-POD, fragments Fab	Roche Group	11426346910	Aliquoter et conserver à –20°C. Garder un aliquot de travail à 4°C.
Anti-digoxigénine-POD, fragments Fab	Roche Group	11207739910	Comme ci-dessus.
Système TSA Plus Fluorescéine	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Préparer chaque flacon de réactif TSA uniquement au moment de l’utilisation. Dissoudre dans 60μl de DMSO. Conserver à 4°C.
Système TSA Plus Cyanine5	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	Comme ci-dessus
Système TSA Plus Cyanine3	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	Comme ci-dessus
Kit TSA n°16 tyramide AlexaFluor647 (plus HRP-anticorps de chèvre anti-IgG de lapin)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Dissoudre le réactif tyramide dans 150μl de DMSO, aliquoter et conserver à –20°C.
RNase, sans DNase	Roche Group	11119915001	Fourni sous forme de solution à 500μg/ml
Iodure de propidium	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Fourni sous forme de solution à 1 mg/ml dans l’eau.