Souris d'isolement surrénales cellules chromaffines

Résumé

Surrénales médullaires systèmes de culture de cellules chromaffines sont extrêmement utiles pour l'étude de l'excitation-sécrétion de couplage dans une dans la mise en in vitro. Ce protocole illustre la méthode utilisée pour disséquer les glandes surrénales et ensuite isoler la région médullaire en enlevant le cortex surrénalien. La digestion de la moelle dans les cellules chromaffines unique est alors démontrée.

Résumé

Surrénales médullaires systèmes de culture de cellules chromaffines sont extrêmement utiles pour l'étude de l'excitation-sécrétion de couplage dans une dans la mise en in vitro. Ce protocole illustre la méthode utilisée pour disséquer les glandes surrénales et ensuite isoler la région médullaire en enlevant le cortex surrénalien. La digestion de la moelle dans les cellules chromaffines unique est alors démontrée.

Protocole

Abréviations:
ACC - surrénales cellules chromaffines, E. sol. - solution d'enzyme, E. DMEM - Enrichi Dulbecco Modified Eagle Médium

1. Préparation
   1. Ajouter à la papaïne quantité désirée de E. sol. (40 unités papaïne / 1ml E. sol..).
   2. Activer la papaïne avec carbogène pendant environ 15 minutes sur la glace. Oxygéner Locke tampon sur la glace aussi.
      
2. Dissection
   1. Utilisez la souris 8-10 semaines.
   2. Avant de retirer la digestion oxygénée tampon de Locke et de placer sur la glace.
   3. Reportez-vous à la vidéo pour la procédure de dissection.
   4. Une fois excisée, les glandes place dans oxygénée tampon de Locke.
      
3. Préparation de Gland
   1. Retirez la graisse de la glande.
   2. Bande de cortex de la glande.
      
4. Digestion enzymatique
   1. Filtre stérile oxygéné papaïne.
   2. Faire quatre piscines de la papaïne oxygénée sur une boîte de Pétri.
      1. 3 piscines devrait être d'environ 100uls.
      2. Une des piscines devrait être d'environ 400uls.
   3. Lavez médullaire travers des piscines
      1. 1er au 3 piscines 100ul.
      2. Puis, à travers la piscine 400ul
      3. Pippette 300ul E. sol. et la moelle des morceaux de la piscine 400ul en tube de centrifugeuse.
      4. Qrap parafilm sur le tube de centrifugeuse et le lieu de 37 ° C bain d'eau pendant 20 minutes.
      5. N'oubliez pas de continuer à oxygéner restantes sol. E. contenant de la papaïne.
      6. Après 20 minutes stériles filtre plus E. sol..
      7. Remplacer les vieux médullaire E. bain sol. avec le nouveau filtrée E. sol..
         
5. Triturations
   1. Aspirer et jeter E. sol..
   2. Lavez médullaire dans 1 ml de DMEM E..
   3. Aspirer et jeter E. DMEM.
   4. Ajouter 300ul E. DMEM et triturent 20X avec 1ml pointe.
   5. Coupez le bout 200ul avec une lame de rasoir stérile.
   6. Triturer 5-10X avec pointe 200ul coupé.
   7. Jeter E. morceaux DMEM médullaire de bain. Medium contiendra les débris.
   8. Ajouter 300uls fraîches E. DMEM à médullaire morceaux.
   9. Triturer 20x avec la pointe 200ul
   10. Pippette E. DMEM à microcentrifugeuse tubes withough pièces médullaire. Medium contiendra ACC libre.
   11. Ajouter 300uls fraîches E. DMEM à médullaire morceaux.
   12. Triturer médullaire avec une aiguille de calibre 23,5 seringue 20x.
   13. Combinez E. DMEM des deux triturations. Médullaire morceaux ne devraient pas être présents et doivent maintenant avoir une apparence de plumes.
       
6. Placage
   1. Microfuge E. DMEM à partir des deux dernières étapes de trituration pour les 2,5 minutes à 3,7 g s.
   2. Resuspendre le culot dans 50uls-200 E. DMEM, selon des expériences ultérieures.
   3. Planche 10-30uls sur une lamelle de verre.
   4. Attendre 15 minutes pour les cellules d'adhérer.
   5. Ajouter 750uls de E. DMEM.