La maladie de Parkinson est causée par la perte de l'innervation dopaminergique dans le striatum, qui peut être induite expérimentalement par la 6-OH-dopamine. Nous décrivons comment effectuer une lésion stéréotaxique et de surveiller l'apomorphine induit un comportement de rotation chez la souris. Ce modèle est utile et fiable pour les tests de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson.
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Article de méthode
Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie de Parkinson (MP) affecte au moins 6,5 millions de personnes dans le monde entier, indépendamment du sexe, les frontières sociales, ethniques, économiques ou géographiques. Les symptômes principaux, tels que tremblements, rigidité et bradikinesia, développer lorsque environ 3 / 4 des cellules dopaminergiques sont perdus dans la substantia nigra, et ne parviennent pas à fournir pour la douceur, la régulation coordonnée des circuits moteurs du striatum. La dépression et les hallucinations sont fréquentes, et la démence survient finalement dans 20% des patients. À ce moment, il n'existe aucun traitement pour retarder ou arrêter la progression du Parkinson. Plutôt, les médicaments actuellement disponibles visent plus vers la réduction de ces symptômes. De nouvelles stratégies chirurgicales peuvent passer réversiblement sur les circuits fonctionnellement endommagé par la stimulation électrique des structures cérébrales profondes, mais bien que la stimulation cérébrale profonde est une avancée majeure, il ne convient pas à tous les patients. Il reste donc nécessaire de tester de nouvelles approches de thérapie cellulaire dans des modèles précliniques.
Sélective des perturbations des voies dopaminergiques neurotoxiques peuvent être reproduites par l'injection de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) ou MPTP (1-méthyl-4-phényl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) alors appauvrissant la drogue et l'oxydation qui endommagent les produits chimiques peuvent également reproduire les caractéristiques spécifiques de PD chez les rongeurs. Contrairement à la MPTP, 6-OHDA, provoquent des lésions massives perte irréversible des neurones, et peut être uni-ou bilatérale. Le modèle lésion 6-OHDA est fiable, conduit à des déficits moteurs robustes, et est la plus largement utilisée après 40 années de recherche dans rats1. Comme les interactions entre les cellules greffées et l'hôte peut désormais être étudié plus à fond dans des souris plutôt que chez le rat, le modèle a été transposé à des souris 2,3, où il a été récemment caractérisée 4.
Dans cette vidéo, nous démontrons comment une lésion gauche nigro-striatale voie de souris anesthésiées par lentement livrer 2,0 uL de 6-OHDA par un stéréotaxique inséré micro-seringue aiguille. La perte de l'apport dopaminergique survient en quelques jours, et les déficiences fonctionnelles peuvent être surveillés au cours post-opératoire des semaines et des mois par des rotations d'animaux notation induite par les agents dopaminergiques 5. Ici, nous montrons tout le corps rotations controlatérales survenant 10 minutes après une administration unique sous-cutanée d'apomorphine, mesurée un mois après la lésion. Les résultats et les inconvénients sont discutés ci-dessous.
Protocole
Tous les produits chimiques stockés sous forme solide, comme le 6-OHDA et apomorphine, ont été dilués dans de l'eau d'injection stérile et filtrée dans une hotte à flux laminaire, pour éviter toute contamination. En outre, les neurotoxines et substances neuro ont été entreposés, préparés, manipulés et éliminés conformément aux règlements établis par les directives internationales 6 et le Comité de biosécurité locales.
1 - L'anesthésie et la chirurgie
Adulte souris mâles Swiss (25-30g) sont une prémédication par l'atropine (0,2 mg / kg, sc) pour réduire le tonus vagal puis anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de kétamine (90-120 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) . L'animal est placé sur un coussin chauffant à commande électronique (Insight) pour assurer la température du corps est maintenue à 37 ° C, que l'induction de la sédation prend quelques minutes. Le niveau d'anesthésie est vérifiée tout au long de la procédure en testant l'absence de réflexe de retrait. Dosage anesthésique devrait être ajusté pour chaque souche / colonie. Selon l'animal et la durée de l'intervention chirurgicale, des doses supplémentaires de la kétamine peut être nécessaire. Après cela, une solution saline (NaCl 0,9%) est appliqué sur les deux yeux afin de protéger les cornées de s'assécher et de tester l'absence de réflexe de clignement dans ce premier moment. La fourrure sur la tête entière est rasée avec une tondeuse à assurer le minimum de contact avec les zones non stériles. L'anesthésie locale (xylocaïne) est appliquée aux barres d'oreille pour éviter la gêne. Une seule fois de retrait et de réflexe de clignement ont disparu, indiquant le niveau d'anesthésie est assez profond pour la chirurgie (phase 3), l'animal est placé sur le cadre stéréotaxique utilisant embouchure et de barres d'oreilles spécialement conçu pour cette espèce (Insight). Une fois positionated, d'une pommade ophtalmologique (Marca) est appliqué pour protéger les yeux des animaux à travers toute la chirurgie. C'est seulement après être sûr que les yeux sont correctement protégés, la procédure continuera avec la désinfection de la peau de la région chirurgicale en répétant trois applications de l'iode povidone suivie par 70% d'éthanol, en utilisant des tampons stériles cotons Après, bon positionnement des barres oreille est assurée par des tests pour les mouvements latéraux de la tête (la tête ne doit pas bouger afin de s'assurer que les barres sont solidement fixées). Une bonne inclinaison de la tête dorsoventral sera vérifiée ultérieurement où les repères du crâne sont révélés. Une incision sagittale (1,5 cm) est fait avec un scalpel stérile (# 15 lames). Le périoste sur la zone d'intérêt est légèrement gratté avec une lame neuve, et l'os est essuyée avec le regard stérile et tampons de coton, de découvrir repères du crâne: bregma est défini comme le point d'intersection des sutures sagittale et coronale, tandis lambda est le point d'intersection de la suture sagittale et la ligne de meilleur ajustement passant par les parties gauche et droite de la suture lambdoïde. La pointe d'une aiguille de référence alignés verticalement est d'abord remis à zéro à la bregma, à l'examen au microscope chirurgical, puis déplacé à toucher le point lambda. Si la tête est correctement positionnée, lambda devrait être au même niveau dorso-ventrale que bregma, et les deux points de repère doivent être éloignés de 4,2 mm sur l'axe rostro-caudal. Sinon, les barres oreilles et nez devrait être desserrer et la tête inclinée délicatement autour de l'axe interaural, afin d'atteindre la position désirée, qui définit le «crâne plat» de référence pour les mesures stereotaxical. La pointe de l'aiguille de référence est alors positionné aux coordonnées souhaitées: antéro-postérieure (AP 0.5 mm) et latérales (L -2,0 mm, gauche). L'emplacement est marqué sur le crâne et une petite taille (1,2 mm de diamètre) le trou est ouvert avec un foret stérilisés, en utilisant l'action intermittente pour empêcher la chaleur de la région. Des fragments osseux sont soigneusement enlevés avec une curette dentaires et lavé avec de stériles chaude de NaCl 0,9%. Le stérilisée 5 pl seringue Hamilton (26s jauge; 0,47 mm de diamètre extérieur) est chargé avec la solution de 6-OHDA (ou d'un véhicule pour les animaux de contrôle) et alignés verticalement dans l'appareil de stéréotaxie. La pointe de l'aiguille (de type 2 ou 12 coniques °) est alors insérée dans le trou ouvert, jusqu'à toucher la surface piales, pour déterminer la référence de la coordonnée dorso-ventrale. Une fois déterminée cette coordonnée, l'aiguille est descendu lentement pour atteindre les coordonnées du striatum (AP: 0,5; L: -2,0 et DV: -3,0 mm, en dessous de la surface piales 7). La solution de 6-OHDA (10 ug 6-OHDA dans NaCl 0,9% avec de l'acide ascorbique 0,02%), qui a été préparée et filtrée dans une hotte à flux laminaire, et doit être protégé de la lumière par des feuilles d'aluminium pendant toute la procédure, est ensuite injecté à un débit de 0.1μL/min. Pour les animaux de contrôle, un volume égal de véhicule (0,02% d'acide ascorbique et 0,9% de NaCl dans l'eau stérile) est injecté. Une fois l'ensemble de 2,0 uL a été injecté, la seringue est maintenu en place pendant 5 min avant d'être très lentement rétracté par le cerveau, dans pas moins que dans les 5 minutes. Le crâne est nettoyé et l'incision est refermée à l'aide d'une suture # Nylon 6-0 (Shalon). Pour prendre un supplémentairesoins contre l'infection, un onguent antibiotique local, comme la néomycine, peut être appliqué sur la peau suturée. Les animaux sont retirés de la trame, étant donné 0,5 ml de solution saline (sc.) pour prévenir la déshydratation, et gardé au chaud et sous surveillance étroite jusqu'à la guérison complète. Ils sont alors logés avec nourriture et eau ad libitum. Analgésique est ajouté à la bouteille d'eau potable pour les deux premiers jours après la chirurgie (donné une consommation d'eau moyenne quotidienne de 5,5 ml, et une dose recommandée de 0,03 mg d'ibuprofène / g de poids corporel / jour, ajouter 0,82 ml de 20 mg / ml Ibuprofène-Abbott suspension à 100 ml d'eau potable). Souris guérissent habituellement sans délai de la procédure, l'errance et d'atteindre des boulettes de nourriture de l'eau facilement. Dans tous les cas de malaise apparent, ou tout signe d'infection, les animaux doivent être euthanasiés conformément aux directives locales.
2 - test comportemental
Bien déficience motrice peut être observée après une semaine, un intervalle post-lésionnelle d'un mois est autorisée avant quantification fiable avec le test de rotation. L'animal reçoit une injection sous-cutanée d'apomorphine agoniste DA (0,5 mg / kg), et est placé dans un cylindre opaque de 30 cm de diamètre, placé à 45 cm en dessous de la caméra d'enregistrement. Il est important d'enlever tous les résidus et les odeurs des animaux préalablement testés avant chaque test. Après une période d'habituation 5 min, ses mouvements sont enregistrés sur une période de 5 min. Les deux contre-ipsilatérale et du corps entier de rotation sont mesurés et comparés au groupe témoin (véhicule injectés). Si la procédure a été correctement effectuée, les animaux de contrôle ne présentent aucune rotation, tandis que la 6-OHDA animaux lésés commence à tourner sur le côté controlatéral, puisque l'agoniste active principalement dans le striatum dénervé supersensibles sur le côté lésé. Animaux score de plus de 7 tours (affichant au moins 7 rotations du corps entier controlatéral par minute) sont considérés comme des succès lésé. L'animal peut être renvoyés en toute sécurité à leur logement 30 min après le test, qui peut être répété chaque semaine. Dans nos mains, à moins de 5% des souris lésées affiché des taux de rotation optimales.
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Discussion
Vaste lésion unilatérale de la voie nigro-striatale peut être réalisé de manière fiable chez la souris par une seule injection stéréotaxique de 6-OHDA dans le striatum. L'étendue de la lésion peut être vérifiée post-mortem par immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (qui catalyse la limitation du débit stade de la synthèse de DA, à savoir la conversion de la L-tyrosine en dihydroxyphénylalanine), comme illustré dans la vidéo.
In vivo, les rotations controlatérales induites par l'...
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Déclarations de divulgation
Des expériences ont été effectuées en conformité avec les Lignes directrices internationales pour les soins et l'utilisation des mammifères dans les neurosciences et la recherche sur le comportement 6, Après approbation par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (Comissão de Avaliação de uso de Pesquisa em Animais: UFRJ / CAUAP Protocole # DAHEICB 027). Des mesures adéquates ont été prises pour minimiser la douleur et l'inconfort des animaux de laboratoire.
Remerciements
Soutenu par la Fundação de Amparo une Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) et Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq). Nous sommes reconnaissants aux lecteurs anonymes dont les commentaires nous ont aidés à améliorer à la fois le manuscrit et la vidéo.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorhydrate de kétamine | König | 90-120 mg/Kg | |
| Chlorhydrate de xylazine | König | 10 mg/Kg | |
| Sulfate d'atropine | Isofarma | Isofarma | |
| Chlorhydrate de 6 – hydroxydopamine | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| Acide L-ascorbique | USB Corp., Affymetrix | 0,2 % | |
| Xylocaïne (chlorhydrate de lidocaïne) | AstraZeneca | 5 % 50 mg | |
| Nebacetin (sulfate de néomycine + bacitracine) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| Chlorhydrate de R-(-)-apomorphine | Sigma-Aldrich | 0,5 mg/Kg | |
| Pommade ophtalmique GenTeal à l'hypromellose | Novartis AG | 0,33 % | |
| Ibuprofène | Abbott Laboratories | 4 mg/100 ml d'eau de boisson | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| Chlorhydrate de R-(-)-apomorphine | Sigma-Aldrich | 0,5 mg/Kg |
Références
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
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Réimpressions et autorisations
