Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

Résumé

Cette étude décrit le développement d'une méthode modifiée de CsCl qui purifie facilement T. gondii oocystes à partir des fèces des chats infectés qui sont appropriés pour la manipulation biologique moléculaire et la culture de tissus

Résumé

Toxoplasma gondii est un protozoaire pathogène intracellulaire obligatoire qui infecte habituellement les humains. C'est un apicomplexes bien caractérisés liés à l'origine des flambées des maladies alimentaires et hydriques. L'hôte définitif est l'espèce féline, où la réplication sexuelle se produit résultant dans le développement de l'oocyste hautement infectieuse et résistance à l'environnement. L'infection se produit par ingestion de kystes tissulaires à partir de viande contaminée ou d'oocystes à partir du sol ou l'eau. L'infection est généralement asymptomatique chez les individus sains, mais les résultats dans une infection latente à vie qui peut se réactiver provoquant la toxoplasmose cérébrale et la mort si l'individu devient immunodéprimés. Viande contaminée avec T. kystes gondii ont été la principale source d'infection en Europe et aux Etats-Unis, mais les récents changements dans la gestion des animaux et des pratiques d'élevage et la manipulation des aliments améliorés et les procédures de traitement ont sensiblement réduit la prévalence de T. kystes gondii dans la viande ^{1, 2.} Néanmoins, la séroprévalence chez les humains demeure relativement élevé ce qui suggère que l'exposition des sols contaminés oocystes ou de l'eau est probable. En effet, épidémies d'origine hydrique de la toxoplasmose ont été signalés dans le monde soutenant la théorie de l'exposition à la forme des oocystes de l'environnement pose un risque significatif pour la santé ^3-5. À ce jour, les recherches sur la compréhension de la prévalence de T. oocystes gondii dans l'eau et l'environnement sont limitées en raison du manque d'outils pour détecter les oocystes dans l'environnement ^{5, 6.} Cela est principalement dû à l'absence de protocoles de purification efficaces pour obtenir un grand nombre de très purifiée T gondii oocystes des chats infectés à des fins de recherche. Cette étude décrit le développement d'une méthode de CsCl modifiés qui purifie facilement T. oocystes gondii à partir des fèces des chats infectés qui sont appropriés pour la manipulation biologique moléculaire et la culture de tissus ^7.

Protocole

1. Précautions générales de sécurité quand on travaille avec T. gondii Oocystes

1. Il est important de suivre toutes les précautions de sécurité lorsque vous travaillez avec T. gondii Oocystes. Dans la plupart des individus sains, T. gondii est facilement contrôlée par le système immunitaire, mais un résultat d'infection long de la vie. Les personnes immunodéprimées sont particulièrement sensibles à la toxoplasmose et ne devraient pas manipuler T. gondii Oocystes. Les femmes enceintes devraient également pas manipuler T. gondii Oocystes, parce que l'infection peut causer des malformations congénitales graves ⁸.
T. gondii Oocystes ne doit être manipulé dans un endroit désigné et avec un personnel qualifié. Les panneaux indiquant T. gondii Oocyste travaux sont en cours doivent être affichés pour avertir les autres entrer dans la zone désignée.
2. Porter un équipement de protection individuelle (EPI) comme un sarrau de laboratoire, une blouse jetable, des gants jetables et des lunettes de protection ou un écran facial lors de la manipulation T. gondii Oocystes.
fréquent de gants est recommandé. Ne pas manipuler un équipement de laboratoire avec T. gondii Oocyste contaminés gants.
3. Toujours utiliser des plateaux métalliques autoclavables doublée d'un doublures absorbant jetable lorsque vous travaillez avec T. gondii Oocystes. S'assurer que tous les supports, tubes, etc utilisées sont jetables ou autoclavables.
4. Tous les T. gondii Les déchets doivent être autoclavés à deux reprises pour au moins une heure.
5. Tout le matériel non jetable (grilles, les plateaux, etc) doivent également être autoclavé à deux reprises pour au moins une heure.
utilisée pour aspirer les liquides doivent être connectés à un Vacushield ™ filtre pour empêcher la contamination de la pompe à vide.
6. Tous les laboratoires concernés banc-tops doivent être désinfectés après avoir terminé de travailler avec T. gondii Oocystes. Fraîchement fait l'hypochlorite de 10% devrait être largement appliquée à la zone de travail et a permis à sec. La zone doit ensuite être bien rincé à l'eau.

2. Préparation des tampons et des solutions

1. Préparer une solution à 1 L de 2,2 M de saccharose en dissolvant 752,66 g de saccharose dans 600 ml ddH ₂ O. Remuez et faites chauffer doucement en utilisant une plaque d'agitation chauffée pour dissoudre le saccharose. Une fois complètement dissous, mettre le volume à 1 L avec ddH ₂ O. Ceci devrait être suivi d'une stérilisation par autoclave la solution pendant au moins 20 minutes.
2. Préparer un 1L tampon TE (50 mM Tris-HCl, EDTA 10 mM), pH 7,2 en ajoutant 6,05 g de Tris-HCl et 3,7 g d'EDTA dans 700 ml de DDH ₂ O, ajuster le pH à 7,2 puis porter le volume à 1 L avec ddH ₂ O.
3. Pour le gradient de CsCl, préparer une solution stock de CsCl avec une gravité spécifique de 1,15 (1,15-CsCl) en ajoutant 21,75 g de CsCl avec 103,25 ml de tampon TE. Pour la solution A, mélanger 30 ml de TE avec 20 ml de 1,15 CsCl. Pour la solution B, mélanger 20 ml de TE avec 30 ml de CsCl de 1,15 et 12,5 pi de solution de rouge de phénol. Pour la solution C, mélanger 10 ml de TE avec 40 ml de CsCl de 1,15 (tableau 1).
4. Préparer un 1L solution 1 N d'hydroxyde de sodium (NaOH) en dissolvant 40 g de NaOH dans 800 ml de DDH ₂ O. Une fois dissous, mettre le volume à 1 L avec ddH ₂ O.
5. Préparer une solution à 1 L 2% (en volume) de H ₂ SO ₄ Mélanger 20 ml de H ₂ SO ₄ Avec 980 ml de DDH ₂ O.

3. Float Saccharose

1. Ajouter 10 ml d'une suspension fécale des T. gondii Oocystes, dans 2% H ₂ SO ₄, Dans un tube de 50 ml à centrifuger conique. Il faut noter que la suspension fécale se réfère à des échantillons qui ont été pré-traitées à travers une procédure de flottation du sucrose comme décrit précédemment ⁸. Lorsque les échantillons fécaux sont d'abord récoltés par les chats infectés qu'ils sont traitées par un flotteur de saccharose comme décrit dans la référence 8. Ce flotteur de saccharose supplémentaire est nécessaire pour minimiser encore les débris fécaux reporté sur le processus de purification de CsCl et d'obtenir la plus pure T. gondii Oocystes possible.
2. Neutraliser le H 2% ₂ SO ₄ En ajoutant 6 ml (3 / 5 volumes) de NaOH 1 N à la suspension fécale. Mélangez bien au vortex.
3. Ajouter un volume égal (16 ml) de 2,2 M de saccharose créant une concentration finale de 1,1 M à la suspension fécale et bien mélanger au vortex.
4. Soigneusement superposition du saccharose / suspension fécale avec 10 ml ddH ₂ S à l'aide d'une pipette de 10 ml. Centrifuger la suspension à 1200 xg pendant 20 min à température ambiante sans frein.
5. Recueillir soigneusement l'eau dessus et les couches d'interphase et le transfert à un nouveau tube de 50 ml à centrifuger conique par pipetage de l'interface air-eau sans tourbillonnant de la pipette. Il est important de minimiser les reports de saccharose tout en recueillant la couche d'interphase.
6. Mélanger le reste du saccharose / fécale solution de granulés par vortex le tube.
7. Répéter les étapes 3.4 et 3.5.
8. Porter le volume des deux solutions interphase oocystes à 50 ml avec ddH ₂ O et centrifuger les tubes à 2000 xg pendant 10 minutes à température ambiante.
9. Aspirer le surnageant de chaque tube et granulés resuspendre avec 5 ml de tampon TE et la piscine de la suspension des oocystes ensemble. Le volume total mis en commun devrait être de 10 ml.

4. CsCl gradient

1. Préparer un gradient discontinu de CsCl dans un tube de 50 ml en polycarbonate Oak Ridge en prenant soin de chaque couche sous-jacente en utilisant une seringue de 50 ml avec un calibre 18 à extrémité franche, autoclavable, aiguille en acier, et un robinet d'arrêt 2 voies. Remarque: le rouge de phénol est ajouté à la solution B de distinguer facilement entre les couches de gradient (tableau 1).
2. Ajouter lentement les solutions suivantes pour le tube dans l'ordre indiqué ci-dessous. Il faut noter que le débit ne doit pas dépasser de plus de 0,5 ml / sec.
   1. 10 ml de l'échantillon de suspension TE / oocystes
   2. Solution 8 ml Une
   3. 8 ml de solution B
   4. 8 ml de solution C
3. Centrifuger le tube Oak Ridge à 12.000 xg pendant 60 min à 4 ° C sans frein. L'utilisation d'un rotor à angle fixe est acceptable, mais une grande vitesse balancer les résultats seau dans une meilleure séparation des oocystes dans l'échantillon de suspension avec un minimum de débris frottis fécal sur le côté ou le tube. L'étendue des frottis dépend de la composition de la suspension fécale et donc il peut être nécessaire d'effectuer deux gradients de CsCl si la suspension fécale est extrêmement sale.
4. Après la centrifugation, recueillir la bande oocyste opaque / blanc contenant entre les solutions A et B. Pour minimiser la contamination par des débris fécaux, allez directement à la bande oocyste sans déranger le gradient et de recueillir l'interphase oocyste aide d'une pipette de 10 ml. Transfert de l'oocyste interphase à un nouveau tube de 50 ml à centrifuger conique. Essayez de minimiser la quantité de solution de CsCl aspiration tout en recueillant l'oocyste interphase car il peut poser un problème dans la granulation du oocystes pendant l'étape de lavage.
5. Lavez les oocystes avec 30-40 ml de DDH ₂ O. Centrifuger le tube à 2000 xg à température ambiante pendant 10 min sans frein. Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot d'oocystes. Répéter les 2 lavez fois supplémentaires.
6. A la fin du dernier lavage, aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot dans 10 ml d'acide sulfurique à 2% et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Les oocystes sont maintenant prêts pour d'autres manipulations. La pureté des oocystes peut être contrôlé au microscope par l'absence de débris fécaux dans l'échantillon.