L'isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Résumé

Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

Résumé

Myocytes cardiaques isolés de cœur adulte sont largement acceptés comme un modèle, quelque part à mi-chemin entre les cellules musculaires embryonnaires et néonatales d'un côté et un cœur travaille sur l'autre. Ainsi, les cardiomyocytes servir de bons modèles pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, des enquêtes pharmaceutique ainsi que pour l'exploration de modèles animaux transgéniques. Nous décrivons ici une méthode d'isoler les cellules du cœur. En outre, nous montrons comment une manipulation génétique sur les myocytes cardiaques peuvent être effectuées sans l'élevage d'un animal transgénique: C'est la combinaison de la culture à long terme (1 semaine) et le transfert de gènes adénoviraux. Ce dernier est décrit par la construction du virus de la transduction des cellules. Il peut être utilisé pour l'expression de biocapteurs génétiquement codés (ADB), protéines de fusion fluorescentes, mais aussi pour la protéine sur l'expression et la régulation négative, par exemple en utilisant l'ARNi. Ici, nous fournir un exemple pour l'expression d'une protéine de fusion coloration d'une structure subcellulaire (Golgi). L'expression des protéines peuvent être visualisées par l'imagerie confocale de z-piles pour une reconstruction 3D des structures subcellulaires. Le protocole comprend l'état de l'art dans la culture cellulaire, biologie moléculaire et de biophysique et fournit ainsi une méthode pour explorer de nouveaux horizons en cardiologie cellulaire.

Protocole

Le plus toute la conception du protocole contenant quatre grandes étapes est représenté dans la figure 1. Toutes les étapes sont décrites en détail. L'isolement cellulaire, la transduction et la culture, suivie par imagerie confocale environ 24 heures plus tard, un est consécutive et obligatoire des délais. La construction du virus devrait être fait d'avance sur l'isolement cellulaire et est ensuite utilisée pour la transduction génétique.

1. Isolement des myocytes cardiaques adultes à partir de coeur de rat

1. Des rats Wistar mâles adultes d'environ 250 g en poids (semaines 6-12 ans) sont anesthésiés par injection....

Discussion

La procédure décrite à l'isolement des cardiomyocytes de rat peut être adapté à d'autres espèces, par exemple la souris ^4, si nécessaire. Un paramètre qui doit l'adaptation est le mélange d'enzymes pour la digestion (voir ci-dessous) et aussi la durée de la digestion. Soyez conscient que les cellules de certaines espèces (souris, par exemple) pourrait être plus fragiles que d'autres (chez le rat, par exemple).

Le choix de la collagénase est probablement l'é.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d'anesthésie	Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)		Mélange de 1 ml d'Ursotamin (100 mg/ml de chlorhydrate de kétamine) et de 240 μl de Rompun (2 % de chlorhydrate de xylazine)
Solution de citrate			117,64 mg de citrate de sodium dans 10 ml de solution de NaCl à 0,9 %
Solution A			134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement
Solution A+			Contenu de la solution A plus 0,2 mM EGTA, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement
Solution de libérase	F. Hoffmann‐ La Roche Ltd.	11988476 001	500 μl de solution mère dans 15 ml de solution A (solution mère : 10 mg/ml de Liberase Blendzyme 4 dans de l'eau distillée)
Solution B			Contenu de la solution A plus 200 μM CaCl2 et 0,1 % de solution de DNase
Solution B1/2			Mélange 1:1 de la solution A et de la solution B
Solution de DNase	Sigma-Aldrich	D4527	La désoxyribonucléase I, de type 2 provenant du pancréas de bovin, 40 KU (15 mg) est dissoute dans 5 ml de tampon Tris‐HCl 10 mM, ajusté à pH = 7,35, composition supplémentaire : 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithio–thréitol ; cette solution est mélangée avec 5 ml de glycérol
Solution de protéine de matrice extracellulaire (ECM)	Solution de protéine de matrice extracellulaire (ECM)	E1270	1 ml de solution mère tel qu'acheté est dilué avec 6 ml de milieu M199
Milieu de culture M199	PAA Laboratories	E15‐834	Milieu M199 supplémenté avec 1 μl/ml de solution ITS et 20 μl/ml de solution de pénicilline‐streptomycine (5000 unités/ml)
Solution ITS			25 mg d'insuline, 25 mg de transferrine et 50 μl de solution mère de sélénite sont dissous dans 5 ml d'eau distillée (solution mère : 0,5 mg/ml de sélénite de sodium dans de l'eau distillée). Ajouter quelques gouttes de HCl 1 M jusqu'à obtention d'une solution limpide. Des aliquotes peuvent être congelées.
Tyrode			135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement
Mélange maître			5 μl de tampon 10×PCR‐, 5 μl de MgCl2 (25 mM), 2 μl d'amorce sens, 2 μl d'amorce antisens, 1 μl de dNTP´s (10 mM chacun), 33 μl de H2O, 1 μl de DMSO, 1 μl de polymérase Taq‐ADN par échantillon
Milieu LB‐			10 g/l de tryptone, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl (et 15 g/l d'agar si utilisé comme milieu solide), pH 7,0
Pac I	New England Biolabs	R0547L	Préparation : 50 μg d'ADN, 5 μl de tampon 10×, 0,5 μl de BSA 100×, 0,75 μl de Pac I, compléter avec de l'H2O jusqu'à un volume final de 50μl