Préparation et de la culture d'explants Objectif Rat épithéliales pour l'étude de la différenciation terminale

Résumé

Des explants de la région centrale du cristallin chez le rat l'épithélium de différencier de manière synchrone lorsque cultivées en présence de FGF-2. Microscopie par immunofluorescence de ces cultures peut fournit des informations roman sur l'expression des gènes et des événements de signalisation associées à la différenciation terminale.

Résumé

La surface antérieure de la lentille oculaire est recouverte par une monocouche de cellules épithéliales, qui prolifèrent dans une zone annulaire sous le corps ciliaire. Après la division, ces cellules migrent arrière, où la diffusion de la rétine FGF induit à se différencier dans un tableau postérieure de cellules allongées en fibres optique, qui composent le gros de la lentille. La différenciation des cellules épithéliales du cristallin en fibres lentille peut être induite in vitro par des explants en culture de la région centrale de l'épithélium antérieur, en présence de FGF-2. Les explants sont préparés à partir des lentilles de rats nouveau-nés en enlevant le cristallin de l'œil et de saisir la capsule du cristallin sur la face postérieure avec des pincettes dissection. La capsule postérieure est déchirée puis doucement ouvert et enfoncé dans le fond d'un plat en plastique culture de tissus. Les régions périphériques de l'explant sont enlevés avec un scalpel et la zone centrale est ensuite mis en culture en présence du FGF-2 100ng/ml aussi longtemps que 2-3 semaines, selon les paramètres à étudier. Comme les cellules épithéliales de différencier les explants cultivés en synchronie approximative sur une période de quelques jours ou semaines, le cours du temps de la signalisation et l'expression des gènes peut être déterminé en utilisant des techniques moléculaires, biochimiques et pharmacologiques. Immunofluorescence est un complément puissant à ces méthodes, car elle démontre la localisation subcellulaire des protéines d'intérêt et peuvent révéler les conséquences physiologiques de manipulations expérimentales des voies de signalisation.

Protocole

Partie 1: Retrait des lentilles

Matériel et réactifs:

1. Micro-dissection ciseaux, courbes, bouts arrondis, (tels as.RS-5983, Roboz instruments chirurgicaux Co., Inc, Gaithersburg, MD), les micro-dissection des pincettes, pointe recourbée (comme Roboz # RS5137).
2. Milieu de suspension: Milieu 199 contenant 0,1% d'albumine sérique bovine, 100 unités / ml de pénicilline, la streptomycine 100μg/ml, 2,5 pg / ml d'amphotéricine B. Réactifs sont disponibles chez Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procédure:

1. Euthanasier les rats nouveau-nés (âgés de 2-4 jours), conformément aux directives fournies par le National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Retirez les paupières avec des ciseaux chirurgicaux. Appuyez doucement avec des pinces courbées sur les côtés opposés de l'orbite de l'œil pour forcer l'œil à gonfler vers l'extérieur. Faire une petite incision sur le côté postérieur de l'œil avec les ciseaux. En appuyant avec des pincettes contre le côté de l'œil opposé de l'incision, la lentille et une petite quantité de corps vitré fixé peut alors être forcé à travers la rupture, permettant à la lentille pour être ramassé avec des pincettes courbes. Il faut prendre soin de ne pas briser la capsule du cristallin.
3. Utilisez la pince à épiler courbée pour transférer les lentilles dans un plat en plastique 60mm tissus de culture contenant 5ml chaud, milieu de suspension stérile.

Partie 2: Microdissection d'explants

Matériel et réactifs:

1. Micro brucelles à dissection, 0,1 mm conseils, (comme Roboz RS-4976). Nous utilisons en alliage Dumostar raison de la flexibilité de la pointe, mais d'autres alliages d'acier sont aussi acceptables. Brucelles avec pointes plus mince que 0,1 mm ne sont pas recommandés, car ils ont tendance à casser ou plier lors de cette procédure.
2. Milieu de suspension (voir partie 1)
3. Non supplémenté milieu F12 de Ham ou Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procédure:

1. Les étapes suivantes devraient être effectuées dans un endroit propre, sans courant d'environnement en utilisant des outils de dissection et stériles milieu stérile.
2. L'utilisation d'un microscope stéréoscopique, nettoyer les lentilles de tout tissu adhérant à la pointe de 0,1 mm et une pince à épiler les transférer à une boîte de culture contenant 5ml 60mm seconde milieu de suspension stérile (cette étape permet de réduire la contamination). Avec la pince à épiler, le transfert, le nombre souhaité de lentilles pour une boîte de culture contenant 35mm 5ml stérile, milieu non. (Nous utilisons souvent F12 de Ham (Invitrogen) pour cette étape, car la faible concentration de colorant rend la dissection plus facile, cependant, le milieu 199 est également acceptable Pas d'antibiotiques ou autres ajouts sont nécessaires pendant cette étape..) Autant que 12 explants peuvent être faites dans le centre d'un plat de cette taille. Toutefois, un plat de 35 mm doit être utilisé même si moins explants sont à faire, parce que les outils de dissection ne peut pas être manipulé facilement dans un petit plat. Transférer le plat contenant les lentilles restantes à un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.
3. Identifier la face postérieure de la lentille. Il ya plusieurs façons de reconnaître cela: 1) Le postérieur est plus ronde que l'antérieure, qui est légèrement aplatie, 2) les lentilles rat nouveau-né sous forme de cataractes froid, car ils refroidir à température ambiante pendant la dissection. Si la cataracte froid n'a pas complètement rempli l'objectif, le côté postérieur est le côté le plus éloigné de la région opaque. Si l'opacité a rempli l'objectif, le réchauffement de la parabole à 37 ° C pendant quelques minutes sera l'inverse. Le côté postérieur peuvent être identifiés comme les réformes de la cataracte au refroidissement. 3) Les vestiges de la tunique vasculosa lentis peuvent être visibles sur le côté postérieur. 4) La suture postérieure peut être visible sur le côté postérieur. Identifier correctement le côté postérieur est essentiel, car c'est là que la capsule sera ouverte. Ouverture de la lentille sur la face antérieure va déchirer l'épithélium.
4. Une fois le côté postérieur a été identifié, le tourner vers le haut et saisir la lentille dans la pince à gauche (pour un travailleur droitier). Puis pincer la capsule postérieure avec la pincette droit de produire un petit pli.
5. Tout en tenant la capsule postérieure avec la pince à épiler droite, saisir le pli de la capsule avec les pinces à gauche et tirez les deux paires de pinces à épiler dans des directions opposées pour faire une petite déchirure de la capsule.
6. Alors saisissant le bord de la capsule se rétracter à la pince à épiler, retirez la baisse, d'abord sur un côté, puis de l'autre, en le pressant dans le plastique de la boîte avec la pince à épiler. Répétez cette opération plusieurs fois, se déplaçant tout autour de l'équateur de la lentille, jusqu'à ce que la capsule est fermement attaché à la plaque en de nombreux points. Tenir la capsule en place avec les pinces à gauche, secouez légèrement la masse de fibres avec les pincettes droit de rompre l'attachement entre les cellules des fibres et des cellules épithéliales à l'équateur de l'objectif. Puis poussez la masse de fibres de là, rouler hors de la capsule / épithélium, qui reste attaché au fond de laplat. Continuez ce processus avec toutes les lentilles dans le plat. Retirez et jetez les masses de fibres (ou les enregistrer congelés comme une source de protéines du cristallin pour les autres études).

Partie 3: microdissection et de culture d'explants centrale

Matériel et réactifs:

1. Stérile scalpel jetable, n ° 15 lame, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH)
2. Phosphate stérile saline tamponnée avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Milieu de culture: milieu de suspension contenant 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc St Louis, MO).

Procédure:

1. Avec un scalpel stérile, rogner l'épithélium périphérique (PE), qui contient des cellules dans les premiers stades de la différenciation (figure 1A), laissant une place centrale d'environ 2,0 mm sur un côté, composé de cellules épithéliales centrale uniquement (CE) (figure 1B).
2. Placer la capsule contenant les explants centrale à un cabinet de biosécurité. Laver 3 fois avec du PBS stérile contenant du calcium et de magnésium et une fois avec 1 ml de frais, milieu de suspension équilibrée (37 ° C CO, 5% _2). Ces lavages de réduire considérablement la probabilité de contamination.
3. Ajouter 2 mL de milieu de culture pour induire la différenciation ^1, et le lieu des explants dans un incubateur humidifié, incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO _2. Périodes de la culture peut être aussi courte que quelques heures ou de prolonger aussi longtemps que deux à trois semaines, en fonction du paramètre étudié. Milieu doit être changé tous les deux à trois jours.

Partie 4: La récolte des explants pour l'analyse des événements liés à une différenciation

1. Explants récolte pour l'analyse de protéines ou d'ARN

Matériaux:

1. Brucelles Microdissecting
2. SDS Lysis Buffer ou de l'ARN-tard

Procédure:

1. A la fin de la période d'incubation, éliminer le milieu de culture.
2. Utilisation du microscope stéréoscopique, détacher doucement les bords de chaque explant.
3. Soulevez chaque explant avec la pince à épiler et le transférer dans un tube contenant environ 100 ul de tampon de lyse SDS (pour l'analyse des protéines) ou d'ARN-tard (pour l'analyse de l'ARN). Agiter la pointe de la pince à épiler dans la solution pour s'assurer que l'explant ne colle pas à la pince à épiler.

2. Explants récolte pour immunofluorescence

Matériel et réactifs:

1. Tampon phosphate salin avec du calcium et du magnésium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Tampon phosphate salin (sans calcium ni magnésium) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Paraformaldéhyde à 4% (bioproduits Boston, Worcester, MA)
4. Brucelles Microdissecting
5. Hydrophobe marqueur
6. Lames de microscope
7. 0,25% de Triton X-100 en tampon phosphate salin.

Procédure:

1. Rincer brièvement les explants dans du PBS contenant du calcium et du magnésium.
2. Fixer les tissus en ajoutant paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes à température ambiante.
3. Retirer le fixateur et le remplacer par un tampon phosphate salin. Explants fixes deviennent un peu raide, leur permettant d'être levé et transféré à lames de verre pour l'immunocoloration.
4. Placer une petite goutte de PBS (sans calcium et magnésium) sur la diapositive pour aider à positionner le tissu et empêcher le curling. L'aide de pincettes microdissecting, ascenseur de l'explant et l'insérer dans la goutte sur la lame. Sans toucher l'explant, retirez soigneusement le liquide avec une mèche de papier pour aplatir l'explant sur le verre et laissez le tissu sécher à l'air à température ambiante pendant 3 à 5 minutes.

Figure 1 A. L'épithélium périphériques exprime une différenciation des protéines spécifiques. L'explant a été montré immunocolorées pour la N-cadhérine immédiatement après microdissection. L'expression est vu dans une bande de cellules de l'épithélium périphérique, ce qui indique que les cellules de cette région ont commencé à se différencier. B. L'épithélium périphérique peut être coupé, pour supprimer les cellules qui expriment la N-cadhérine et d'autres protéines spécifiques de différenciation. L'anneau rouge représente l'emplacement des cellules qui expriment la N-cadhérine, tandis que le petit carré décrites dans le quadrant grise représente de l'épithélium montré dans le panneau 1A. L'épithélium périphérique peut être enlevé par quatre coupes de scalpel, laissant une place centrale qui contient uniquement des cellules qui n'ont pas encore commencé à se différencier.

Discussion

Le système explant rat lentille a été utilisé avec succès par un certain nombre de laboratoires pour étudier la différenciation terminale des cellules épithéliales du cristallin aux fibres optique ^21,3,4,5. Lorsqu'ils sont exposés à FGF-2 au 100ng/ml les explants va commencer à montrer les changements dans la signalisation dans les minutes ^6, avec des changements dans la morphologie et l'expression des gènes apparaissant séquentiellement sur ​​plusieurs jours ^3,4,5. Les cultures restent viables pendant 2-3 semaines, si on prend soin d'éviter toute contamination.

Les explants centrale décrite dans ce protocole sont particulièrement utiles pour l'étude de la séquence des événements associés à la différenciation, car ils contiennent peu ou pas de cellules qui expriment des marqueurs de différenciation, avant le FGF-2 est ajouté ^1,5. Les cellules se différencient ensuite synchrone, comme une cohorte, ce qui permet de suivre l'évolution temporelle de la signalisation et les événements transcriptionnels associés à la différenciation. Explants de culture différentes longueurs de temps fournit donc des informations précises sur les événements temporels séquence. Des inhibiteurs spécifiques peuvent être ajoutés au milieu de culture afin d'identifier les voies de signalisation pertinente. Explants peuvent être utilisés pour analyser l'expression des protéines par électrophorèse sur gel SDS et immunoempreinte ou pour analyser l'expression des ARNm spécifiques par RT-PCR. Protéines rendements large de 20 à 50 mg / explant et le rendement en ARN est d'environ 200 à 600 ng / explant, selon la longueur de la période de culture. En général, nous constatons que 5-6 explants par boite fournira suffisamment de protéines ou d'ARN pour des essais de plusieurs années. ARN à partir d'explants peut également être utilisé pour préparer l'ADNc pour évaluer l'expression des gènes par l'analyse des microréseaux, qui permet d'identifier de nouveaux gènes qui peuvent être cruciaux pour la différenciation. Explants peuvent également être transfectées. Bien que l'efficacité de la transfection est généralement faible, il est suffisant pour le dosage de gènes rapporteurs ^{4, 7, 8.} Immunofluorescence des explants fournit un complément utile à des méthodes biochimiques, en déterminant la localisation subcellulaire des protéines d'intérêt. Ainsi, la préparation et à la culture d'explants lentilles rat fournit un système puissant pour l'étude de différenciation terminale optique chez les mammifères, ce qui peut compléter des techniques in vivo, comme la génération de souris transgéniques et knock-out.