Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

Résumé

Une méthode pour isoler des types cellulaires spécifiques du matériel végétal est démontrée. Cette technique utilise des lignes de marqueur transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans des types cellulaires particuliers, cellulaire dissociation et de tri cellulaire activé par fluorescence. De plus, une installation de croissance est établi ici, qui facilite le traitement des Arabidopsis thaliana Semis avant le tri cellulaire.

Résumé

Haute résolution, le type spécifique de cellules d'analyse de l'expression génique améliore considérablement la compréhension de la régulation du développement et des réponses aux stimuli de l'environnement dans tout organisme multicellulaire. Hybridation in situ et la visualisation gène rapporteur peut dans une certaine mesure être utilisés à cette fin, mais pour une grande résolution quantitative RT-PCR ou haut-débit à l'échelle d'analyse du transcriptome à l'isolement de l'ARN à partir des types cellulaires particuliers sont requis. Cellulaire dissociation des tissus exprimant un marqueur fluorescent protein dans un type cellulaire spécifique et ultérieures de tri cellulaire par fluorescence (FACS), il est possible de collecter des quantités suffisantes de matériel pour l'extraction d'ARN, d'ADNc analyse de synthèse / amplification et de biopuces.

Un vaste ensemble de cellules spécifiques au type de lignes rapporteur fluorescent est disponible à la communauté scientifique des plantes. Dans ce cas, deux lignes de marqueur de la racine d'Arabidopsis thaliana sont utilisées: P _RCS:: GFP (endoderme et le centre de repos) et P _WOX5:: GFP (centre de repos). Un grand nombre (des milliers) de jeunes plants sont cultivés en hydroponie ou sur plaques de gélose et d'obtenir du matériel récolté assez de racines pour une analyse ultérieure. Cellulaire de dissociation de la matière végétale est obtenue par digestion enzymatique de la paroi cellulaire. Cette procédure permet l'utilisation de haute osmolalité induite par plasmolyse et cellulases disponibles dans le commerce, pectinases et hémicellulases pour libérer protoplastes dans la solution.

FACS de GFP-positives cellules permet l'utilisation de la visualisation des verts contre les spectres d'émission rouge de protoplastes excité par un laser à 488 nm. GFP-positives protoplastes peuvent être distingués par leur ratio est passé du vert à l'émission de rouge. Les protoplastes sont généralement triés directement dans un tampon d'extraction de l'ARN et stockés pour un traitement ultérieur à une date ultérieure.

Cette technique se révèle être simple et réalisable. Par ailleurs, il est démontré qu'il peut être utilisé sans difficulté d'isoler un nombre suffisant de cellules pour l'analyse du transcriptome, même pour des types de cellules très rares (par exemple les cellules du centre de repos). Enfin, une installation de croissance des semis d'Arabidopsis est démontré que le traitement permet simple des plantes avant de tri cellulaire (par exemple pour le type spécifique de cellules d'analyse des réponses au stress biotiques ou abiotiques). Supplémentaires éventuelles utilisations des FACS des protoplastes végétaux sont discutées.

Protocole

1) Préparation du matériel végétal

1. Les protoplastes peuvent être dérivées de nombreuses espèces de plantes différentes et des tissus sous réserve que la bonne combinaison de la paroi cellulaire des enzymes digérant est utilisé ^1. Avant une expérimentation à grande échelle est entreprise, une digestion à petite échelle de la matière est conseillé afin d'évaluer l'efficacité protoplastes du tissu, des enzymes, etc, et d'estimer les cellules pour cent positif pour le tri cellulaire. Ici, les protoplastes dérivés à partir des racines des plants d'Arabidopsis thaliana cette cellule de type expriment spécifiquement la protéine fluorescente ve....

Discussion

Les protoplastes peuvent, en principe, être dérivé d'une variété de tissus végétaux, l'optimisation des conditions favorables permettra d'améliorer grandement la qualité et la quantité d'ARN. Tant la solution protoplastes et le tampon d'incubation élective utilisés auront une influence sur cet aspect.

Beaucoup de différentes protéines fluorescentes peuvent être utilisés, selon les capacités de la FACS utilisé, par exemple, la GFP, RFP, YFP, CFP ou de leurs nombre.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Maille en nylon de 250 μm	Sefar Filtration	NITEX 03-250/50
Maille en nylon de 100 μm	Sefar Filtration	NITEX 03-100/47
Boîtes de Pétri carrées	Fisher Scientific	08-757-10k
Phytatrays	Sigma-Aldrich	P1552
Milieu basal de Murashige et Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3
MES	Sigma-Aldrich	M2933
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	Solution mère à 10 M
Microscope Eclipse 90i	Nikon Instruments
Cellulase R-10	Yakult Pharmaceutical
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9546
KCl	Sigma-Aldrich	P8041	Solution mère à 1 M
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
β-mercapto–éthanol	Calbiochem	444203
CaCl2	Sigma-Aldrich	C2536	Solution mère à 1 M
Agitateur orbital	Labline Instruments
Filtre cellulaire de 40 μm	BD Biosciences	352340
Tubes coniques de 15 ml	BD Biosciences	352196
Centrifugeuse de table	Sorvall, Thermo Scientific	Legend RT
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
FACSAria	BD Biosciences
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 ml	VWR international	20170-38
Kit RNeasy micro	Qiagen	74004
Système d'amplification d'ARN WT-Ovation Pico	NuGEN	3300_12
Module biotine FL-Ovation d'ADNc V2	NuGEN	4200_12