Mesure cérébrale oxygénation sanguine à base d'oxygène-dépendant trempe de phosphorescence

Résumé

Nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer la pression partielle d'oxygène (pO2) dans le système vasculaire cérébrale à base d'oxygène-dépendant trempe de phosphorescence. La préparation des animaux et des procédures d'imagerie ont été décrites pour les deux grand champ de vue CCD à base d'imagerie de pO2 chez le rat et l'imagerie 2-photons d'excitation basée sur pO2 chez la souris.

Résumé

Surveillance des caractéristiques spatio-temporelle des sanguin cérébral et l'oxygénation des tissus est cruciale pour une meilleure compréhension de la relation de neuro-métaboliques-vasculaires. Développement de nouvelles modalités de mesure avec la pO2 surveillance simultanée de pO2 dans les grands champs de vue avec une meilleure résolution spatiale et / ou temporelle permettra de mieux comprendre le fonctionnement du cerveau normal et également avoir un impact significatif sur le diagnostic et le traitement des maladies neurovasculaires tels que accident vasculaire cérébral, maladie d'Alzheimer, et de blessures à la tête.

Modalités d'imagerie optique ont montré un grand potentiel pour fournir une haute résolution spatio-temporelle et l'imagerie quantitative de pO2 basé sur l'absorption d'hémoglobine dans la gamme visible et infrarouge proche du spectre optique. Cependant, la mesure de l'oxygénation du sang multispectrales cérébrale repose sur la migration des photons à travers le tissu cérébral hautement diffusant. Estimation et modélisation des paramètres optiques des tissus, qui peuvent subir des changements dynamiques au cours de l'expérience, est généralement requis pour l'estimation précise de l'oxygénation du sang. D'autre part, l'estimation de la pression partielle d'oxygène (pO2) à base d'oxygène-dépendant trempe de phosphorescence ne doit pas être significativement affectée par les changements dans les paramètres optiques du tissu et fournit une mesure absolue de la pO2. Systèmes expérimentaux qui utilisent l'oxygène des colorants sensibles ont été démontrées dans des études in vivo des tissus perfusés ainsi que de surveillance de la teneur en oxygène dans les cultures de tissus, montrant que la phosphorescence de trempe est une technologie puissante capable d'imagerie oxygène précis dans le physiologiques pO2 gamme.

Ici nous démontrons avec deux différentes modalités d'imagerie comment effectuer la mesure de la pO2 dans le système vasculaire corticale basée sur l'imagerie à vie de phosphorescence. Dans la première démonstration, nous présentons l'imagerie grand champ de vue de la pO2 à la surface corticale de rat. Cette modalité d'imagerie a relativement simple dispositif expérimental basé sur une caméra CCD et un laser pulsé vert. Un exemple de suivi de la dépression corticale propagation basé sur la durée de vie de phosphorescence d'un colorant R3 Oxyphor a été présenté. En deuxième démonstration, nous présentons une haute résolution à deux photons pO2 imagerie vasculaire micro corticale de souris. Le montage expérimental comprend une coutume construit deux photons microscope avec un laser femtoseconde, modulateur électro-optique, et de comptage de photons tube photomultiplicateur. Nous présentons un exemple de l'imagerie de l'hétérogénéité pO2 dans la microvascularisation corticale notamment capillaires, utilisant un nouveau PTP-C343 colorant avec améliorée 2-photons section transversale d'excitation.

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Protocole

1. Large champ de vue de l'imagerie pO2 dans le système vasculaire corticale de rat

1. Les rats (250 g -350 g) sont d'abord anesthésiés à l'isoflurane, et l'artère et la veine fémorales sont cathétérisés pour surveiller le rythme cardiaque, pression artérielle, et des gaz du sang, ainsi que pour perfusion intraveineuse. La température corporelle est maintenue à 37 ± 0,1 ° C. La trachéotomie est réalisée, et les rats sont ventilés avec un mélange d'air et d'oxygène.
2. Des échantillons de sang pour mesurer les gaz du sang sont prélevés toutes les 30 à 45 min et la ventilation et l'anesthésie sont ajustés pour maintenir les gaz du sang dans les limites physiologiques normales.
3. Une fenêtre fermée crânienne sur l'os pariétal 4 mm x 4 mm est préparé pour l'imagerie. L'os et la durée sont supprimées et la fenêtre crânienne est rempli avec 1,5% d'agarose et scellé avec une lamelle de microscope. Un montant supplémentaire de 1 mm ² trou de trépan sur l'os frontal est utilisé pour induire la CDD par microinjection intracorticale de KCl (~ 10 pl, 1 M). Un soin extrême doit être pris pour éviter tout dommage de la vascularisation corticale. L'excès de chaleur, une pression mécanique, ou brève période d'hypoxie peut compromettre barrière hémato-encéphalique et provoquer des fuites de la teinture de la vascularisation dans l'espace interstitiel.
4. Un masque à partir de matériaux optiquement opaque est placé autour de la fenêtre crânienne. Le but du masque est d'absorber le signal de phosphorescence qui vient de la teinture qui a fui dans le tissu sur les bords de la dure-mère. Le colorant dans l'espace interstitiel est la source de la phosphorescence très lumineux qui peuvent gâcher la mesure. La luminosité accrue du colorant dans l'espace interstitiel est le résultat de l'accumulation de colorant dans l'environnement avec une pression en oxygène est faible et le taux de trempe faible. Les dégâts de la vascularisation dans l'expérience est donc facilement reconnaissable par l'apparition de taches lumineuses phosphorescence, dans ce cas, les données expérimentales est rejetée.
5. Après achèvement de la chirurgie, l'isoflurane est interrompu et l'anesthésie est passé à alphachloralose (50 mg / kg en bolus intraveineux suivie par 40 mg / (kg h) de perfusion).
6. Animale est transféré sur un chariot avec ventilateur, la pression sanguine et de surveiller la température. Bien respirer l'air ambiant, l'animal est rapidement passé à l'installation d'imagerie et rattaché au débitmètre avec le mélange approprié d'air et d'oxygène.
7. Le cadre stéréotaxique qui détient l'animal est placé sous l'objectif. La fenêtre crânienne est centré dans le champ de vue sous l'objectif et placé parallèlement au plan focal.
8. Le laser pulsé est activé et réglé à l'énergie d'impulsion minimale. Le faisceau optique est dirigé vers compteur d'énergie d'impulsion et d'énergie impulsion délivrée à l'échantillon est ajustée pour être pas plus de 10 mJ / cm ^2. L'ISS faisceau centré sur la fenêtre crânienne avec un angle d'incidence oblique de ~ 60 degrés et laser de l'ISS éteint.
9. Mesures des gaz du sang et des ajustements de la ventilation et l'anesthésie sont effectués jusqu'à ce que tous les paramètres physiologiques de l'animal se trouvait à portée physiologique normal.
10. En supposant que le volume de sang est d'environ 7% du poids du corps, une quantité appropriée de la R3 Oxyphor sonde phosphorescence est dissous dans 1 ml de solution saline pour atteindre 4 x 10 ^-5 M concentration sanguine de la sonde. La solution de sonde est injecté par la veine fémorale.
11. Une solution à 1 M de chlorure de potassium est préparé et ~ 1 ul est injecté à la seringue à travers le trou de trépan sur l'os frontal pour induire la CDD.
12. Le laser est activé et l'imagerie est démarré immédiatement après l'injection de la solution de KCl. Imagerie de phosphorescence est effectuée pendant environ 10 minutes.
13. Une autre mesure des gaz du sang est effectuée pour confirmer que les paramètres physiologiques des animaux sont toujours dans la plage normale.
14. Phosphorescence vies sont obtenus pour tous les pixels en ajustant la décroissance exponentielle simple à l'aide de montage carrés non linéaires avec pondération statistique dans MATLAB. Phosphorescence vies sont convertis à la pO2 valeurs en utilisant une approche empirique Stern Volmer-comme la relation (voir infra).

2. Haute résolution à deux photons pO2 imagerie vasculaire micro corticales de souris

1. Les souris sont anesthésiées avec l'artère fémorale est isofluorene et cathétérisés pour surveiller le rythme cardiaque, pression artérielle, et des gaz du sang, ainsi que pour l'administration de la teinture. La température corporelle est maintenue à 37 ± 0,1 ° C et les animaux sont en respiration spontanée d'un mélange d'air et d'oxygène.
2. Une fenêtre crânienne est préparé selon la technique développée à l'origine par David Kleinfeld et Winfried Denk. Un bon soin devraient être prises pour éviter tout dommage de la vascularisation pour éviter toute fuite du colorant dans l'espace interstitiel.
3. Un peu d'échantillons de sang pour mesurer les gaz du sang sont prises lors d'une procédure de préparation et de l'ensemble de ventilation et d'anesthésie sont ajustées pour garder le gaz du sanges dans les limites physiologiques normales.
4. L'animal est déplacé à l'installation d'imagerie. Un cadre stéréotaxique modifiés qui détient l'animal est placé sous l'objectif. La fenêtre crânienne est centré dans le champ de vision sous l'objectif de l'Olympe 4X et positionné parallèlement au plan focal.
5. Une image de la fenêtre crânienne est pris avec l'appareil photo numérique à travers les oculaires, et l'objectif 4X est remplacé par l'Olympus 20X objectif (NA = 0,95).
6. Mesures des gaz du sang et des ajustements de la ventilation et l'anesthésie sont effectués jusqu'à ce que tous les paramètres physiologiques de l'animal sont dans une fourchette physiologique normal.
7. En supposant que le volume de sang est d'environ 7% du poids du corps, une quantité appropriée de la phosphorescence de sonde PTP-C343 est dissoute dans 0,2 ml de solution saline pour atteindre environ 15 uM concentration sanguine de la sonde. La solution de sonde est injecté par l'artère fémorale.
8. Commencez l'expérience par la mise en intervalles de temps désiré pour l'excitation de colorant et de collecte des émissions à chaque pixel.
9. Acquérir un scan enquête qui est un balayage de trame lente 2-dimensionnelle de variation d'intensité de phosphorescence qui affiche la structure vasculaire à la profondeur actuelle. L'objectif est déplacée perpendiculairement à la fenêtre crânienne (axe Z) et lent scans levé 2D de l'intensité de la phosphorescence sont prises en utilisant la puissance du laser minimale à 840 nm de trouver les microvaisseaux dans le plan d'imagerie.
10. A chaque profondeur d'imagerie, basée sur l'analyse enquête de phosphorescence à cette profondeur, un ensemble de points dans la vascularisation sont sélectionnés, et l'enregistrement de désintégrations de phosphorescence à chaque point est répétée pour un nombre prédéfini de la moyenne.
11. Réglez la quantité désirée de la moyenne, l'intervalle de mesure, et durée de l'expérience et de commencer la mesure. pO ₂ mesures sont acquises aux endroits choisis à l'intervalle de mesure spécifiée pour la durée de l'expérience.
12. Lors des mesures, le logiciel redirige le laser d'excitation à l'emplacement sélectionné en changeant la position des miroirs de balayage galvanomètre. Contrôle des scanners galvanomètre, électro modulateur optique, et tous les autres équipements sont effectuées par le logiciel fait sur mesure dans LabVIEW.
13. Phosphorescence vies sont obtenus pour tous les points sélectionnés en ajustant la décroissance exponentielle simple à l'aide de montage non linéaire carrés dans Matlab. Phosphorescence vies sont convertis à la pO2 valeurs en utilisant une approche empirique Stern Volmer-comme la relation (voir infra).
14. Après la collecte des données à différentes profondeurs corticale, injecter dextran conjugué fluorescéine dans les vaisseaux sanguins pour l'imagerie de la structure microvasculaire.
15. Procurez-vous une pile d'images structurelles de la vascularisation en effectuant l'imagerie à deux photons de fluorescence FITC utilisant un canal vert dans le détecteur à quatre canaux.
16. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Sous Massachusetts General Hospital sur le soin des animaux de recherche.

3. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Panel (a) sur le côté gauche de cette figure affiche un large champ de vue de l'image pression d'oxygène avant l'arrivée d'une vague de CDD. Panneau (b) sur le côté droit montre l'évolution temporelle de la pression d'oxygène en moyenne pendant la propagation CDD au sein de la région d'intérêt a marqué sur le panneau (a).

Figure 2 (AVI film): Ce film montre l'évolution temporelle de la pression d'oxygène dans toute la fenêtre crânienne pendant la propagation de l'onde CDD. La barre d'échelle indique la pression d'oxygène en millimètres de mercure.

Figure 3. Projection en 3D de la pile de la vascularisation imagée. Les nuances de gris représentent un masque cuve volumétrique, créé sur la base de l'image structurelle. Mesuré pO ₂ valeurs sont codés par couleur. La barre d'échelle est de 200 micromètres. Reproduit avec la permission de Nature Publishing Group. ⁷

Discussion

Nous avons démontré deux applications de la mesure de la pO2 dans la microvascularisation corticale à base d'oxygène-dépendant trempe de phosphorescence. Alors que la première méthode basée sur l'imagerie CCD fournit large champ de vue de la surveillance pO2, mesure de la pression partielle d'oxygène dans microvascularisation corticale repose sur deux microscopie biphotonique offre une résolution capillaire et permet l'imagerie en profondeur. Ces deux méthodes fournissent haute vitesse et haute de signal...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glycopyrrolate	Réactif	American Regent Inc.	NDC 0517-4605-25	Utilisé pour contrôler les sécrétions pharyngées, trachéales et bronchiques.
Lidocaïne HCL	Réactif	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01	Utilisée comme anesthésie locale pendant les interventions chirurgicales.
Isoflurane	Réactif	Baxter Internationl Inc.	NDC 10019-360-40	Utilisé comme anesthésique inhalatoire général pendant les interventions chirurgicales et comme anesthésie générale lors d'expériences sur des souris.
Alpha Chloralose	Réactif	Sigma-Aldrich	C0128	Utilisé comme anesthésie générale lors d'expériences sur des rats.
Fluorescein isothio-cyanate–dextran	Réactif	Sigma-Aldrich	FD2000S	Administré pour obtenir une concentration d'environ 500 nM dans le sang.