Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.
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Article de méthode
Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d'actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le poisson zèbre est un modèle idéal pour les comportements d'imagerie cellulaire pendant le développement in vivo. Embryons de poisson zèbre sont fécondés à l'extérieur et donc facilement accessible à toutes les étapes de développement. En outre, leur clarté optique permet d'imagerie à haute résolution de la cellule et de la dynamique moléculaire dans le milieu naturel de l'embryon intact. Nous utilisons une approche d'imagerie en direct à analyser les comportements lors de la migration des cellules de crête neurale de cellules et de l'excroissance et l'orientation des axones neuronaux.
Imagerie Live est particulièrement utile pour comprendre les mécanismes qui régulent les processus motilité cellulaire. Pour visualiser les détails de la motilité cellulaire, comme l'activité de propulsion et de dynamique moléculaire, il est avantageux de marquer des cellules individuelles. Dans le poisson zèbre, l'injection d'ADN plasmidique donne une mosaïque d'expression transitoire et offre des avantages distincts par rapport aux autres méthodes de marquage des cellules. Par exemple, des lignées transgéniques qualifient souvent les populations de cellules entières et peuvent donc occulter la visualisation des saillies fines (ou des changements dans la distribution moléculaire) dans une seule cellule. En outre, l'injection de l'ADN au stade d'une cellule est moins invasive et plus précise que les injections de teinture à des stades ultérieurs.
Nous décrivons ici une méthode pour l'étiquetage individuel des neurones en développement ou les cellules de la crête neurale et l'imagerie par leur comportement in vivo. Nous injectons ADN plasmidique dans une cellule embryons au stade, qui se traduit par l'expression du transgène mosaïque. Les vecteurs contiennent des cellules de promoteurs spécifiques de cette expression d'entraînement d'un gène d'intérêt dans un sous-ensemble de neurones sensoriels ou des cellules de la crête neurale. Nous fournissons des exemples de cellules marquées à la GFP membrane cible ou avec une sonde biocapteur qui permet la visualisation de la F-actine dans les cellules vivantes 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce travail.
Protocole
1. Assemblée des diapositives et des diapositives d'injection d'imagerie
Diapositives d'injection:
- Préparer élastomère de silicone Sylgard conformément aux instructions du fabricant.
- Utilisez le Sylgard d'obligations à trois microscope en verre standard de diapositives ainsi que par l'empilement d'une diapositive sur le dessus de l'intersection des deux autres diapositives, qui sont disposés côte à côte sur les bords longs. Le chariot supérieur crée un angle droit ou de "mur" entre le haut et glisse en bas.
- Laissez Sylgard mis nuit. Ces lames sont réutilisables.
Diapositives d'im....
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Discussion
La concentration optimale de l'ADN injecté varie selon la taille et la force du promoteur de construire et doit être déterminée empiriquement. L'injection d'ADN trop peut conduire à des embryons malsaine avec la mort cellulaire étendue, tandis que trop peu se traduira par une très faible proportion des embryons injectés exprimant le transgène. Le niveau d'expression d'ADN est corrélée avec la force du signal fluorophore, qui varie de cellule à cellule. Alors que le tri des embryons en épifluorescence.......
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH R01 NS042228 au MCH L'Olympus FV1000 confocale a été acquise avec une instrumentation NIH partagé octroi S10RR023717 au ministère UW Zoologie (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri, et Matthew Clay ont contribué également à ce document.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tricaïne (méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Kit d'élastomère de silicone Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Kit QIAfilter Plasmid Midi | Qiagen | 12243 | |
| Agarose à bas point de fusion | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
Références
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U.
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Réimpressions et autorisations
