Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Résumé

Ce protocole vidéo illustre l'isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Résumé

L'angiogenèse est un complexe multi-étapes, où, en réponse à des stimuli angiogéniques, les nouveaux navires sont créés à partir de la vascularisation existante. Ces étapes comprennent: la dégradation de la membrane basale, la prolifération et la migration (germination) des cellules endothéliales (CE) dans la matrice extracellulaire, l'alignement de la CE en cordons, la formation de lumière, anastomose, et la formation d'une nouvelle membrane basale. Beaucoup d'essais in vitro ont été développées pour étudier ce processus, mais la plupart ne reproduisent certaines étapes de l'angiogenèse, et morphologiquement les vaisseaux souvent ne ressemblent pas à des navires in vivo. Ici nous démontrons une optimisation dans le dosage angiogenèse in vitro qui utilise la veine ombilicale humaine CE et les fibroblastes. Ce modèle reprend toutes les étapes clés au début de l'angiogenèse, et surtout les vaisseaux d'affichage lumens brevets intercellulaire entouré par polarisée CE. Les navires peuvent être facilement observées en contraste de phase et de time-lapse microscopie, et récupéré à l'état pur pour des applications en aval.

Protocole

Procédure

1. Lay cordon sur le pavé propre et tamponnez hors excès de sang. Faire des coupes fraîches sur les deux extrémités de la corde.
2. Insérez 21 1 / 2 G aiguille avec la gaine en plastique sur l'aiguille, dans la veine. (La veine est la plus grande ouverture, les deux plus petits sont des artères)
3. Clamp l'aiguille en place avec une pince hémostatique et de fixer la seringue 20cc de Hanks à l'aiguille.
4. Poussez le Hanks dans la veine avec une pression modérée. Collecter les déchets dans le bécher avec l'eau de Javel. (Holding de l'aiguille et le cordon d'une main tout en poussant l'aiguille empêcherait sortent de la veine.) S'il ya beaucoup de sang dans les veines, se laver une seconde fois.
5. Lay cordon sur le pad et pince l'autre extrémité de la veine. Remplir avec quelques mL de Hanks pour vérifier les fuites le long de la moelle. Retirer la dose de 5 mL et déconnecter la pince inférieure.
6. Déconnecter la seringue 20cc. Retirer le piston de la seringue de 10cc. Attacher une seringue de 10cc à l'aiguille, versez 10 ml de collagénase et de remplacer le piston. Poussez la collagénase dans la veine jusqu'à ce que vous voyez la quantité d'abord sortir l'extrémité ouverte. Re-pince le bout ouvert et de remplir avec de la collagénase jusqu'à il ya une distension modérée de la veine. Distension des résultats Trop de contamination du muscle lisse.
7. Massez le cordon doucement.
8. Incuber cordon (avec pinces hémostatiques, aiguille et la seringue jointe) dans du DPBS à 37 ° C pendant 15 min.
9. Alors que l'incubation, continuent les étapes 1-8 avec 2 ^ème cordon.
10. Après incubation, prenez le cordon hors du bécher et tout en tenant la corde sur le tube de 50 ml couper l'extrémité au-dessus du collier inférieur. Soyez sûr de tout collecter dans le tube. Poussez la collagénase restantes par le cordon, puis fixer la seringue 20cc et pousser Hanks travers avec une pression modérée.
11. Si aucune des cellules musculaires lisses sont nécessaires, jeter le cordon pour le moment. Sinon, placez la même corde dans un second tube 50ml avec de la collagénase ~ 5ml et incuber à 37 ° C pendant 30-60 min.
12. Garder le tube jusqu'à ce que tous les cordons sont faits.
13. Spin tubes à ~ 1200 rpm pendant 5 min.
14. Aspirer le surnageant (sauf pour ~ 1-2 ml). Reprendre le culot dans 5mls PHEC + et la plaque dans un T25.
15. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant la nuit.
16. Le lendemain, retirer le surnageant et la remplacer par du milieu frais. S'il ya des globules rouges nombreuses, se laver une fois avec M199, puis ajoutez + PHEC. Poursuivre l'incubation comme d'habitude jusqu'à la plaque est confluente (1-4 jours). Divisé en une T75 gélatinisé.
17. Une fois que T75 est confluente, divisé en trois T75s. Gel de deux flacons par flacon.

Remarque: les cellules endothéliales (non activé) ont un aspect pavimenteux. Les cellules endothéliales sont parfois activé (long et pointu) juste après l'isolement, après une couple de passes, ils retournent généralement dans un état ​​inactive.

Nettoyage

1. Très soigneusement, jeter les aiguilles dans le collecteur de déchets.
2. Disposez des seringues dans les containers prévus à grande.
3. Mettez tous les tissus dans le sac pour matières contaminées petits. Fermer le sac et congeler à -20 ° jusqu'à ce que l'incinération.
4. Faire tremper les instruments dans virucide pour au moins 10 min.
5. Ajouter le média d'incubation pour les déchets bécher / eau de javel. Laisser reposer pendant au moins 10 min.
6. Jeter les plaquettes banc en déchets biologiques dangereux.
7. Vaporiser vers le bas à l'intérieur et l'extérieur de béchers, paillasse et le couvercle bain d'eau avec vircide. Laissez reposer 10 min, puis essuyez.
8. Rincez béchers et des instruments à l'eau tiède et accrocher sur une grille pour sécher (blot hors les instruments pour qu'ils ne rouillent pas).
9. Eliminer les déchets décontaminés dans l'évier.
10. Retour supports inutilisés au réfrigérateur.
11. Jeter les gants dans les déchets biologiques dangereux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Collagénase à 0,1 %			10 mL par cordon, préchauffé à 37 °C
Flacons de culture tissulaire			T75, un par cordon.
Milieu de Hanks
ciseaux			stériles
bécher			stérile
tubes de 50 mL