La cellule perméables réticulant DSP [dithiobis (succinimidyl propionate)] stabilise les interactions transitoires et labiles In vivo, Qui permet leur isolement à l'aide des techniques rigoureuses purification des protéines recombinantes complexes. Nous présentons ici une technique pour les cellules de réticulation en culture suivie de l'isolement de complexes protéiques par immunoprécipitation.
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Article de méthode
Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d'affinité immuno-magnétiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La nature dynamique des machineries cellulaires est souvent construit sur des associations de protéines transitoires et / ou faible. Ces interactions faible affinité empêche méthodes rigoureuses pour l'isolement et l'identification des réseaux protéiques autour d'une protéine d'intérêt. L'utilisation de réticulants chimiques permet la stabilisation sélective des interactions labiles, contournant ainsi les limites biochimiques pour la purification. Nous présentons ici un protocole prêtent des cellules en culture qui utilise un réticulant homobifonctionnels avec un bras espaceur de 12 Å, dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP). DSP est clivée par réduction d'un pont disulfure présent dans la molécule. Réticulation combinée avec la chromatographie d'immunoaffinité de protéines d'intérêt avec des billes magnétiques permet l'isolement de complexes protéiques qui, autrement, ne résisterait pas à la purification. Ce protocole est compatible avec les techniques habituelles de western blot et il peut être étendu pour l'identification des protéines par spectrométrie de masse 1.
Stephanie A. Zlatic et Pearl V. Ryder ont contribué également à ce travail.
Protocole
1. Préparation pour la réticulation
- Vous aurez besoin de la plaque d'un nombre suffisant de cellules pour permettre l'isolement de 500 pg de protéines par tube de réaction standard. Un tube unique peut être suffisante pour l'identification des interacteurs putatif d'une protéine d'intérêt par immunoblot. Dans ce cas, perles du matériel lié peut être élue avec un tampon d'échantillon SDS-PAGE (immunoprécipitation). Pour l'analyse par spectrométrie de masse, le nombre de réactions norme devrait être augmenté d'au moins dix fois et les complexes de protéines doit être élue par hors compétition avec un antigène peptidique reconnue par l'anticorps utilisé (chro....
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Discussion
DSP, une membrane perméable-, réticulant chimiquement réductibles à un bras espaceur de 12 A est utilisé pour stabiliser les interactions entre protéines passagères 1,2,3,4. Ici, nous témoigne de cette stratégie avec le complexe adaptateur AP-3 d'un complexe protéine soluble qui reconnaît et trie les protéines membranaires dans des vésicules à partir des endosomes 5. AP-3 se lie sélectivement au transporteur de zinc ZnT3 et la kinase lipidique phosphatidylinositol-4-kinase de type II, mais pas .......
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à VF (NS42599 et GM077569).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution saline tamponnée au phosphate | Invitrogen | P4417 | Dissoudre 1 comprimé dans 200 mL d'eau ; ajouter du MgCl2 à une concentration finale de 1 mM et du CaCl2 à une concentration finale de 0,1 mM |
| Dithiobis (propionate de succinimidyle) (DSP) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22585 | Sensible à l'humidité, conserver dans un récipient hermétique à 4°C |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Triton X-100, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Dynabeads, anticorps IgG de mouton anti-souris | Invitrogen | 110.31 | Les billes sont également disponibles sous forme d'anticorps de mouton anti-lapin |
| AIMP Dyna-Mag-2 | Invitrogen | 123-21D |
Références
- Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G.
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Réimpressions et autorisations
