In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

Résumé

Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

Résumé

Démêler le réseau d'interaction des molécules

Protocole

Impression par microcontact:

1. Découpez domaine de Microdétail du timbre en PDMS aide d'un scalpel
2. Lavez le champ contenant le Microdétail en le rinçant à l'éthanol (100%) et de l'eau distillée.
3. Sécher le timbre en PDMS à l'azote ou de gaz argon.
4. Pipeter 50 ul solution BSA-Cy5 travaux (0,67 mg / ml) sur le timbre en PDMS afin que l'ensemble du champ Microdétail est couverte de solution. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
5. Lavez le domaine Microdétail en le rinçant à tampon phosphate salin (PBS) et de l'eau distillée.
6. Sécher le PDMS à l'azote ou de gaz argon.
7. Placez le timbre en PDMS sous son propre poids sur le milieu de l'un revêtement époxy lamelle et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une boîte de Pétri.
8. Étiquette de la position du timbre en PDMS sur le dos de la lamelle et la bande du timbre de la lame avec une pince.
9. Coller une chambre de fermeture sécurisée hybridation sur le champ microcontact-imprimée sur la lamelle. L'étiquette permet de localiser le centre du terrain.
10. Pipeter 60 ul solution de travail de la streptavidine (50 pg / ml) dans la chambre de réaction et incuber l'échantillon pendant 60 min à température ambiante.
11. Laver l'échantillon avec 1 ml de PBS en ajoutant le tampon dans un port de la chambre et le retirer simultanément le second port avec une pompe.
12. Pipeter 60 pl solution biotinylé travaux d'anticorps (10 ug / ml dans du PBS supplémenté avec 0,1% de Tween 20; "PBST") dans la chambre de réaction et incuber pendant 60 min à température ambiante.
13. Laver l'échantillon avec 1 ml PBST et ensuite 1 ml de PBS en ajoutant le tampon dans un port de la chambre et le retirer de nouveau à la deuxième port avec une pompe.
14. Stocker les surfaces micropatterned en PBS dans le noir à température ambiante jusqu'à cellules sont prêtes pour l'ensemencement.

L'incubation des cellules sur la surface micropatterned:

1. Cultiver des cellules adhérentes à 50% de confluence dans une plaque de 3 cm de culture de tissu.
2. Détachez les cellules exprimant des protéines appâts et proies d'intérêt avec l'acide éthylènediamine (EDTA) et de solution de centrifugeuse 5 min à 1000 rpm.
3. Jeter le surnageant et dissoudre le culot cellulaire dans le milieu de croissance en fonction.
4. Centrifuger 5 min à 1000 rpm.
5. Jeter le surnageant et dissoudre le culot cellulaire dans un milieu de croissance approprié.
6. Bourse du PBS de la chambre de réaction sur la lamelle micropatterned par 60 pi de la suspension cellulaire.
7. Créer une chambre humidifiée par trempage d'une compresse stérile dans l'eau distillée et le mettre dans la boîte de Pétri pour empêcher l'échantillon de tourner à sec.
8. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans une atmosphère de CO ₂ 5% sur les surfaces micropatterned.
9. Avant d'analyser les cellules au microscope, l'échange du milieu par une solution de Hank s saline tamponnée dont Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.}

Microscopie:

1. La lamelle est placée sur une monture adaptée et la morphologie des cellules est contrôlée dans la lumière blanche.
2. La qualité de la BSA-Cy5 modèles est vérifiée par une excitation à 647 nm.
3. Micropatterns de protéines proies fluorescente (GFP ou YFP) sont enregistrés à 488 ou 514 nm sous réflexion totale (TIR) ​​d'excitation interne.

Les résultats représentatifs:

Si il ya une interaction entre les protéines cibles dans les cellules cultivées sur une surface micropatterned, la proie suivra la redistribution des appâts. Le Microdétail résultant peut être visualisé par le label de fluorescence de la protéine proie. Surtout le contraste obtenu fournit une mesure directe de la force d'interaction (voir Figure 1). Par conséquent, une simple évaluation de l'interaction des deux protéines devient possible - sans la nécessité de continuer à traiter les données mesurées primaire.

Figure 1. Réarrangement de l'appât dans la membrane plasmique de cellules vivantes à des forces d'interaction différents. TIR images de cellules transfectées avec T24 (a) CD71-CD71-GFP sur des anticorps, (b) des CD4 et la YFP cytosolique sur les cellules CD4-anticorps et (c) GPI-GFP-DAF sur la CD59-anticorps microbiochips sont affichés. Les données sont caractéristiques de forte (a), non (b) ou interaction faible (c). (A) est reproduite à partir de (Weghuber et al., Sous presse), (b) de (Schwarzenbacher et al., 2008).

Discussion

La vidéo qui l'accompagne montre une méthode pour détecter les interactions protéine-protéine dans le plasma de la membrane des cellules vivantes (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, sous presse). En principe, n'importe quelle plateforme de microscopie TIRF basé peut être utilisé comme système de lecture. Ce n'est que lorsque la sensibilité élevée est souhaitée (par exemple pour la détection de molécules uniques), les microscopes de pointe seront nécessaires. Pour obtenir les meilleurs résultats les points critiques suivants pendant le processus de préparation nécessitent une attention particulière:

1. Magasin de Cy5-solution-mère dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore et préparer la BSA-Cy5 solution de travail fraîchement avant l'impression par microcontact.
2. Attention à ne pas rayer la Microdétail sur le PDMS avec la pointe de la pipette et incuber l'échantillon dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore.
3. Mettez la lamelle sur une compresse stérile pour empêcher le collage de la lame de verre pour la boîte de Pétri. Une fois le timbre en PDMS a adhéré à la lame de verre, ne pas le déplacer.
4. Eviter les bulles d'air dans la chambre de réaction et incuber l'échantillon dans des conditions sombres pour éviter le blanchiment du fluorophore.
5. Ne laissez pas l'échantillon sec pendant plus de 2 minutes pour éviter la formation de cristaux de sel.
6. Pour le détachement des cellules de ne pas utiliser la trypsine comme il cliver le domaine extracellulaire de protéines membranaires jusqu'à présent exprimé. Eviter la trypsine sera utile pour les protéines avec faible taux de rotation pour former micropatterns immédiatement après la fixation des cellules sur la surface.
7. Contrôle le nombre de cellules incubées dans un microscope et faire en sorte que les cellules n'atteignent pas plus de 30-50% de confluence. Assurez-vous que les cellules excès sont enlevés immédiatement en raison de la fixation rapide des cellules sur la surface revêtue d'anticorps.
8. Seules les diapositives de haute qualité BSA-Cy5 modèles peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure.
9. Une expression stable de la protéine fluorescente est préférable proies due à une plus grande nombre de cellules qui peuvent être analysées par balayage.
10. Adéquate de réglage FRBR est indispensable pour visualiser les modèles en raison de fond cytosolique.

La technique de micro-motifs propose plusieurs possibilités pour l'analyse des interactions protéine-protéine. Tout d'abord, avec la quantification des locaux, résolues spatialement interactions protéine-protéine a également la détection des interactions faibles ou indirecte n'est possible sans l'inconvénient de donner un nombre élevé de faux positifs ou négatifs. Deuxièmement, elle permet au chercheur d'analyser les interactions entre protéines dans le plasma de la membrane des cellules vivantes, ce qui est difficile à réaliser par des approches biochimiques comme l'écran 2-hybride. Troisièmement, l'approche permet la détection de l'appât-proie interactions qui sont modulés par les changements environnementaux comme la température, la présence de différentes protéines ou autres molécules ou modifications post-traductionnelles. Ainsi, le test de dépistage permet de modulateurs de l'interaction d'une paire donnée dans le contexte de cellules vivantes. Par ailleurs, en réduisant la densité de surface du ligand de capture ou de l'utilisation de ligands monovalents, l'analyse de l'état de repos devient possible. Enfin, si les plates-formes adéquates de numérisation sont utilisés, le nombre de cellules analysées est suffisamment élevé pour correspondre à la demande haut débit des entreprises pharmaceutiques pour le dépistage de drogue (Ramm, 2005).