Montage de cerveaux de drosophile adulte : une méthode de préparation de lames pour l’imagerie confocale

Ce protocole est un extrait de Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Montage de cerveaux adultes de D. melanogaster sur des lames de microscope et imagerie

1. Construisez un toboggan « pont ». Placez deux lamelles de « base » à environ 1 cm l’une de l’autre sur une glissière chargée positivement. Assurez-vous que le côté chargé positivement de la glissière est orienté vers le haut. Collez les lamelles sur la lame avec du vernis à ongles comme indiqué dans Figure 1A. Il est généralement utile de sceller les trois bords extérieurs de chaque lamelle de base avec du vernis à ongles pour s’assurer que le support de montage ne s’évacue pas sous ces lamelles de couverture de base. Laissez le vernis à ongles sécher complètement (10 à 15 min) avant de continuer.
2. Placez la lame sous le stéréomicroscope et pipetez la solution de support de montage contenant les cerveaux disséqués dans l’espace entre les deux lamelles. Pour offrir plus de contraste, il est utile de manœuvrer les lumières à col de cygne de manière à ce qu’elles soient parallèles au dessus de la paillasse.
3. Retirez le support de montage supplémentaire de la lame à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas pipeter le cerveau de la lame.
4. Évacuez les supports de montage supplémentaires. Cela permettra de positionner plus précisément le cerveau lors de l’étape suivante.
5. À l’aide d’une paire de pinces et du stéréomicroscope, positionnez les cerveaux sur la lame en grille avec les lobes antennaires vers le haut.
6. Placez une lamelle (le « pont ») sur les cerveaux (Figure 1A). Utilisez du vernis à ongles pour sceller les côtés de la lamelle de pont là où ils entrent en contact avec les lamelles de « base ».
7. À l’aide d’une pipette p200, remplissez lentement la cavité centrale sous le pont avec un nouveau support de montage (Figure 1B). Placez une goutte à la fois sur le bord ouvert de la lamelle centrale et laissez le support de montage s’évacuer sous la lamelle du pont central. Continuez jusqu’à ce que toute la cavité soit remplie de support de montage, puis scellez le haut et le bas avec du vernis à ongles transparent.
8. Une fois que le vernis à ongles est sec, imagez immédiatement les lames ou rangez-les dans une boîte étanche à la lumière à -20 °C.
9. En l’espace d’une semaine, imagez les cerveaux à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec des lasers d’excitation et des cubes de filtre appropriés aux anticorps secondaires fluorescents choisis. Les images Z-stack des neurones du corps du champignon sont généralement obtenues à l’aide d’objectifs 20X ou 40X. L’imagerie des neurones photorécepteurs rétiniens peut nécessiter un grossissement plus élevé.

Figure 1 : Montage de cerveaux en vue de l’imagerie par immunofluorescence. (A) Les cerveaux sont montés sur des glissières SuperFrost Plus avec un couvercle de pont pour empêcher l’aplatissement des cerveaux. Deux lamelles de couverture « de base » sont collées sur une lame Superfrost Plus chargée positivement avec du vernis à ongles transparent et des cerveaux disséqués sont ensuite placés sur la lame entre eux. Une lamelle transparente est placée au-dessus de la cervelle et collée sur les lamelles de base. (B) Une fois que le vernis à ongles a séché, Vectashield est lentement pipeté sous le pont pour préserver la fluorescence de l’anticorps secondaire. Du vernis à ongles transparent est ensuite utilisé pour sceller le haut et le bas de la lamelle de recouvrement « pont ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.