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Ce protocole est un extrait de Zhang et al, L’intestin de C. elegans comme modèle de morphogenèse de la lumière intercellulaire et de biogenèse de la membrane polarisée in vivo au niveau de la cellule unique : marquage par coloration des anticorps, analyse de la perte de fonction de l’ARNi et imagerie, J. Vis. Exp. (2017).
Coloration par anticorps de l’intestin de C. elegans
- fixation
- Prenez une lame de verre propre et utilisez de la poly-L-lysine pour générer une fine pellicule sur laquelle les vers peuvent coller. Placez 30 μL de poly-L-lysine à 0,1-0,2 % sur la lame et placez une deuxième lame sur la goutte de poly-L-lysine pour former un « sandwich ». Frottez ensuite doucement les lames plusieurs fois pour mouiller toutes les surfaces des deux et laissez-les sécher à l’air libre pendant 30 minutes. Étiquetez le côté givré des lames avec pencil.
REMARQUE : Des aliquotes de poly-L-lysine à 0,2 % de 200 μL ont été obtenues en dissolvant la poudre dans dH2O ; celui-ci peut être stocké à -20 °C. Utilisez de la poly-L-lysine de haut poids moléculaire pour une meilleure adhérence des vers. La concentration de poly-L-lysine est également critique. Des concentrations trop faibles ne permettront pas aux vers de se coller, mais des concentrations trop élevées peuvent générer un signal de fond de fluorescence. Un film trop épais peut se desserrer dans son intégralité.
- Placez fermement un bloc métallique plat sur le fond d’un récipient (par exemple un récipient en polystyrène) rempli d’azote liquide.
REMARQUE : On peut utiliser de la glace sèche à la place, mais l’azote liquide maintient un bloc métallique plus stable sur le fond du récipient et refroidit bien.
- Collectez les vers soit en les lavant de leurs assiettes avec M9, soit en choisissant différents vers de stade (œufs, vers de stade larvaire L1, L2, L3 ou L4) sur chaque lame. En règle générale, choisissez ~100 larves et embryons ou ~20 adultes sur chaque lame. Placez 10 μL de vers lavés au milieu de la lame ou choisissez les œufs/vers dans 10 μL M9 ou 10 μL 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate).
- À l’aide d’une pipette, étalez un grand nombre de vers afin d’éviter l’agglutination.
Remarque : Les populations mixtes de vers lessivés, en raison de l’encombrement et de l’épaisseur différente des étapes, ne collent pas bien et sont moins efficacement fissurées par la congélation (voir ci-dessous), donc la sélection de vers spécifiques à un stade (ou de populations synchronisées) donne des résultats supérieurs. Les larves collent mieux que les adultes et plus d’animaux peuvent être placés par lame.
- Avant de choisir les vers sur les lames, transférez-les sur une plaque de milieu de croissance de nématodes (NGM) sans bactéries OP50. L’excès de bactéries adhérentes aux vers peut également interférer avec l’adhérence. Veillez à ce que les vers ne se dessèchent pas.
- Placez doucement (déposez) une lamelle de 22 mm × de 22 mm en travers sur les vers collectés de sorte que ses bords dépassent d’au moins un côté de la glissière. Appuyez tout droit doucement mais fermement avec un ou deux doigts sur la lamelle. Évitez le cisaillement qui endommagerait l’intégrité des tissus.
- Transférez immédiatement et doucement la lame sur le bloc métallique dans de l’azote liquide et laissez-la reposer pendant environ 5 minutes pour qu’elle gèle. Ensuite, « effleurez » la lamelle d’un seul geste rapide en utilisant le bord en surplomb.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée de manière décisive et pendant que la lame est gelée pour obtenir une « fissuration » de la cuticule. Attention : Veuillez suivre les directives EPI (équipement de protection individuelle) lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.
- Plongez les lames fissurées par congélation dans un bocal Coplin en verre rempli de méthanol pendant 5 min à -20 °C. Transférer ensuite dans un bocal en verre Coplin rempli d’acétone pendant encore 5 min à -20 °C.
REMARQUE : Le méthanol et l’acétone doivent être conservés à -20 °C pendant au moins 30 minutes avant d’être utilisés. Après fixation, les lames peuvent être stockées à -20 °C.
ATTENTION : le méthanol et l’acétone sont toxiques.
- Retirez les lames du bocal et laissez-les sécher à l’air libre à température ambiante (RT) avant utilisation.