Ce protocole est extrait de Teoh et al, Approches quantitatives pour l’étude des structures cellulaires et de la morphologie des organites chez Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Préparation des lames pour l’imagerie
- Préparez du bouillon d’agarose à 3-4 % p/v dans une bouteille allant au micro-ondes (3-4 g dans 100 ml d’eau ultra-pure).
REMARQUE : L’agar peut être utilisé à la place de l’agarose à la même concentration.
- Faites fondre l’agarose avec précaution dans un four à micro-ondes, en prenant soin de ne pas trop bouillir, jusqu’à ce que toute l’agarose se dissolve (solution claire). Maintenir la solution à 70 °C pour éviter la solidification.
REMARQUE : Le stock d’agarose peut être utilisé plusieurs fois. Réchauffer avant utilisation si l’agarose s’est solidifiée.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, placez une goutte d’agarose fondue sur une lame de microscope.
REMARQUE : Évitez d’avoir des bulles d’air dans la goutte de gélose car elles perturbent l’intégrité du tampon.
- Appuyez immédiatement sur la gouttelette d’agarose à l’aide d’une autre lame de microscope, en aplatissant doucement l’agarose en un tampon entre les deux lames.
REMARQUE : Toutes les bulles restantes doivent être éliminées à ce stade. Sinon, de nouvelles diapositives doivent être faites car les animaux peuvent facilement se coincer dans les bulles. Évitez le débordement de gélose sur le côté lors de la pression sur la glissière.
- Laissez sécher l’agarose pendant 1 min.
- Séparez soigneusement les deux lames pour éviter d’endommager l’agarose, tout en laissant le tampon solidifié sur l’une des lames.
REMARQUE : Les lames avec des tampons d’agarose doivent toujours être préparées fraîches juste avant l’expérience car elles peuvent se dessécher. Assurez-vous que le tampon d’agarose a une épaisseur constante. Il ne doit pas y avoir de bulles d’air ou de fissures dans le tampon, car cela pourrait interférer avec l’imagerie.
- Ajouter une petite goutte (5-10 μL) de chlorhydrate de tétramisole à 0,05 % (anesthésique) au centre du tampon d’agarose.
- À l’aide d’un pic stérilisé thermiquement, transférez rapidement environ 10 à 15 animaux de la plaque de stock à la gouttelette d’anesthésique avant que la solution ne sèche. Évitez de transférer trop de bactéries OP50 car cela rend la solution trouble, ce qui peut interférer avec l’imagerie.
REMARQUE : Si la solution anesthésique sèche pendant la cueillette, il suffit de pipeter une deuxième goutte de chlorhydrate de tétramisole à 0,05 % sur les animaux. Les animaux ont tendance à se coucher sur leur côté latéral dans la solution anesthésique.
- Appliquez une lamelle en la positionnant juste au-dessus du tampon d’agarose et en la laissant tomber doucement. Cela évitera la formation de bulles. N’appliquez pas de pression sur la lamelle car cela pourrait écraser les animaux.
- Étiquetez les lames avec le nom de la souche.