$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Le protocole suivant est un extrait de Cornwell et al, The Replica Set Method : A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
1. Prévention de la production de descendance par l'ajout de 5-Fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR)
- Faites croître les animaux jusqu’au stade L4 à 20 °C. Vérifiez si les animaux synchronisés ont atteint L4 environ 40 heures après l’ensemencement (étape 2.1.7).
NOTE : Le temps de développement de C. elegans variera à différentes températures et les taux de croissance des animaux mutants pour lesquels les taux n’ont pas été caractérisés doivent être testés empiriquement.
- Ajouter 160 μL de 50x FUdR dans chaque plaque de 6 cm avec des animaux L4.
REMARQUE : Il est essentiel d’ajouter FUdR à l’étape L4. Pour plus de commodité, préparez 1 000 fois les stocks de FUdR en dissolvant 1 g de FUdR dans 10 mL de H2O ultrapur. Filtrez-stérilisez le stock FUdR avec un filtre de 0,2 μm et une seringue de 10 cc. Aliquote ~1 mL de stock dans des tubes stériles de 1,5 mL. Congeler et conserver à -20 °C.
- Inspectez les plaques pour détecter la présence de C. elegans mâles. Retirez tous les mâles.
REMARQUE : La durée de vie est généralement mesurée pour les hermaphrodites et non pour les mâles. Les hermaphrodites qui s’accouplent vivent moins longtemps que les animaux non accouplés, même en présence de FUdR. Les mâles sont plus petits et plus minces que les hermaphrodites et peuvent être facilement identifiés par une queue crochue distinctive.
- Remettez la boîte dans le sac à fermeture éclair. Retourner dans l’incubateur à 20 °C.
2. Évaluation de la viabilité
- Évaluez la viabilité quotidiennement en touchant doucement la tête de l’animal avec un fil de platine ou des cils. Marquez les animaux qui ne bougent pas comme morts et retirez-les de la plaque (figure 1A). Enregistrez le nombre de morts observées pour chaque condition pour chaque point de temps d’observation.
REMARQUE : Pour réduire le risque de biais de notation, l’expérimentateur doit rester aveugle aux conditions expérimentales et ne doit pas non plus faire référence aux résultats de points temporels précédents lors de la notation.
- Censurez les animaux qui se rompent, meurent d’autres défauts de développement évidents ou rampent sur le côté de la parabole : retirez ces animaux et notez le nombre à chaque point de temps observé pour en tenir compte dans l’analyse statistique. De plus, si des mâles sont trouvés, retirez-les et notez le nombre observé.
- Répétez l’opération à partir de l’étape 2.1 tous les jours jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’animaux en vie.
REMARQUE : Si la pelouse d’E. coli diminue considérablement ou si des champignons commencent à se développer sur la plaque, transférez tous les animaux restants dans une nouvelle plaque avec l’ARNi et le FUdR appropriés.
