Digestion enzymatique et dissociation manuelle : une méthode pour préparer les embryons de C. elegans pour la culture cellulaire

Résumé

Source : Sangaletti, R. et Bianchi, L. Une méthode de culture de cellules embryonnaires de C. elegans.J. Vis. Exp.(2013).

Cette vidéo présente une méthode permettant d’isoler et de cultiver stérilement des cellules embryonnaires de C. elegans in vitro.

Protocole

1. Dissociation des cellules embryonnaires

1. Effectuez les étapes suivantes de la procédure dans des conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire. Alors que les animaux sont habillés sur des plaques antibactériennes, les lavages et le traitement avec la solution de lyse contenant de l’eau de Javel devraient éliminer la plupart, sinon la totalité, des bactéries. Ainsi, l’utilisation d’un capuchon laminaire à ce stade de la procédure empêche une nouvelle contamination de la suspension d’œufs.
2. Remettre en suspension les œufs granulés dans 1 ml de chitinase à 2 mg/ml (bouillon dans un tampon à œufs pH 6,5) et les transférer dans un nouveau tube conique stérile de 15 ml. Secouez le tube pendant 10 à 30 minutes à température ambiante. Le temps exact d’incubation change en fonction de la fraîcheur de l’enzyme et de la température de la pièce et doit donc être déterminé pour chaque préparation. Il est recommandé de commencer à surveiller les œufs au microscope de culture cellulaire inversée après 10 minutes d’incubation. Remarque : d’après notre expérience, un pH bas augmente l’activité enzymatique de la chitinase. Pour cette raison, nous utilisons un tampon d’œuf à pH 6,5 pour dissoudre la chitinase (recette rapportée ci-dessus, où le pH est ajusté à 6,5 à l’aide de NaOH).
3. Lorsque ~ 80 % des coquilles d’œufs sont digérées par le traitement à la chitinase (figures 1 A-B), granulez les œufs par centrifugation à 900 x g (~2 500 tr/min) pendant 3 min. À l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts stériles, retirez soigneusement le surnageant et ajoutez 3 ml de milieu L-15.
4. Transférez les œufs dans une plaque de 6 cm de diamètre et dissociez doucement les cellules à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml équipée d’une aiguille de 18 G. Surveillez le degré de dissociation en plaçant une goutte de suspension dans une boîte de Pétri en plastique frais et en observant au microscope. N’aspirez pas d’air dans la seringue pendant cette procédure pour éviter d’endommager les cellules. Continuez la dissociation jusqu’à ~ 80 % des cellules sont dissociées.
5. Filtrez la suspension à l’aide d’un filtre Millipore stérile de 5 μm. Les suspensions cellulaires doivent être filtrées afin d’éliminer les amas de cellules, les œufs non digérés et les larves écloses. Filtrez 4 à 5 ml supplémentaires de média L-15 frais à travers le filtre pour récupérer toutes les cellules. N’utilisez pas de force excessive pendant l’étape de filtration pour éviter d’endommager le filtre et/ou les cellules.

2. Culture des cellules

1. Granulez les cellules dissociées par centrifugation à 900 x g (~2 500 tr/min) pendant 3 min. À l’aide d’une pipette P1000 et d’embouts stériles, retirez soigneusement tout le surnageant. Remettre en suspension les cellules granulées dans le milieu L-15 complet et la plaque 1 ml/puits. La quantité de support ajoutée dépend du nombre de 8P plaques utilisées, la confluence des vers sur les plaques et le type d’expériences qui seront effectuées sur les cellules. La densité cellulaire peut être déterminée à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les enregistrements patch-clamp, une densité de placage de ~ 230 000 cellules/cm² est optimale.
2. Conservez la plaque à 24 puits dans un récipient en plastique Tupperware contenant des serviettes en papier humides pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Conservez le récipient dans un incubateur humidifié à 20 °C et à l’air ambiant.
3. Les cellules sont généralement prêtes pour les expériences dans les 24 heures, lorsque la différenciation morphologique et l’expression des marqueurs GFP sont terminées. Les cellules peuvent être conservées en culture jusqu’à 2 semaines, mais elles sont généralement plus saines jusqu’à 7 à 9 jours après le placage. Le milieu doit être remplacé une fois par jour pour maintenir des cellules saines.

Résultats

Figure 1. Embryons de C. elegans avant et après le traitement à la chitinase. (A) Photographie d’œufs avant l’exposition à la chitinase. La flèche pointe vers la coquille d’œuf transparente et intacte qui entoure un embryon. (B) Œufs traités avec de la chitinase pendant 10 min. Les coquilles d’œufs ont été digérées et ne sont plus visibl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RÉACTIFS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	Référence 11415-064
Sérum de bovin fœtal	Invitrogen	Référence 16140-063
Pénicilline-streptomycine	sigma	P4333-100ML
Chitinase de Streptomyces Griseus	sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	sigma	L0881-10MG
ÉQUIPEMENT
101-1000 μl Pointes de pipette graduées bleues	États-Unis Scentific	Référence 1111-2821
Pipette stérilisée de 10 ml emballée individuellement	États-Unis Scentific	Référence 1071-0810
Pipette ergonomique à volume variable (100-1000 μl) avec éjecteur de pointe	VWR International Inc.	Référence 89079-974
Aide à la pipette portable, Drummond	VWR International Inc.	Référence 53498-103
Pipette en plastique de transfert stérile	VWR International Inc.	Référence 14670-114
Tube conique de 15 ml	États-Unis Scentific	Référence 1475 à 1611
Aiguilles stériles de calibre 18	Becton, Dickinson et Cie.	305196
Seringues stériles de 10 ml	Becton, Dickinson et Cie.	305482
Filtres à seringue en plastique Corning 0,20 μm taille des pores	Corning	431224
Filtre à seringue acrodique de 25 mm avec membrane versapor de 5 μm	VWR International Inc.	Référence 28144-095
60x15 mm Boîte de Pétri stérile	VWR International Inc.	Référence 82050-548
100x15 mm Boîte de Pétri stérile	VWR International Inc.	Référence 82050-912
12 mm de diamètre Couvre-lames en verre	VWR International Inc.	Réf. 48300-560
Plaques de culture cellulaire transparentes à fond plat 24 puits avec couvercle	Thomas scientifique	Référence 6902A09
Dumont #5- Pince fine	Outils scientifiques fins	Référence 11254-20
Centrifugeuse 5702	Eppendorf	22629883
Hotte à flux laminaire
Microscope inversé avec objectif x10
Incubateur humidifié à l’air ambiant