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Le protocole suivant est un extrait de Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
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Étapes à effectuer la veille du test
- Prélever les vers de stade L4 sur des plaques de milieu de croissance de nématodes frais (NGM) ensemencées avec une pelouse d’OP50 E. coli, et les cultiver à 20 °C O/N. Chaque condition de test nécessite 10 vers ; choisissez un excès de vers pour permettre la perte O/N des vers.
- N’analysez que les animaux qui sont des adultes du premier jour ; de nombreux mutants grandissent à une vitesse plus lente que le type sauvage. Ajustez le moment de la cueillette pour les souches qui présentent des retards de développement afin que tous les animaux testés soient des adultes du premier jour.
- Étapes à effectuer le jour du dosage
- Préparation pour le test :
- Effectuer des dosages sur des plaques NGM standard non ensemencées de 60 x 15 mm. Séchez toutes les plaques à utiliser à 37 °C pendant 2 heures, sans couvercle. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées ; il s’agira des plaques d’analyse de l’éthanol 0 mM et 400 mM et des plaques d’acclimatation qui les accompagnent.
REMARQUE : L’utilisation de plaques NGM est importante ici ; Des différences dans la composition des plaques, en particulier leur osmolarité, peuvent fortement affecter la relation dose-réponse de l’éthanol sur le comportement, cela est dû, au moins en partie, à des modifications de la quantité d’éthanol accumulée par les animaux. La gélose NGM est de 160 mOsm.
- Après séchage, pesez chacune des plaques NGM non ensemencées à utiliser dans l’essai et notez le poids. Déterminez le volume de support dans les plaques en fonction du poids d’une plaque vide. Pour estimer la conversion du poids de la gélose en volume, supposons que le milieu pèse le même poids qu’un volume égal d’eau.
REMARQUE : Nos résultats les plus cohérents ont été obtenus avec des milieux NGM qui se sont suffisamment déshydratés pour qu’un volume original de 10 ml ait un volume post-séchage compris entre 8,3 et 8,9 ml. Une alternative au temps de séchage de 2 heures consiste à sécher jusqu’à ce que les plaques atteignent cette plage de volume pour tenir compte des différences entre les incubateurs.
- Faites fondre 4 anneaux de cuivre (diamètre intérieur de 1,6 cm) à la surface de chacune des plaques pour servir de corrals pour les différents génotypes ou groupes de traitement des vers. Saisissez chaque anneau à l’aide d’une pince et chauffez-le à une flamme (une forte flamme d’un bec Bunsen fonctionne bien) pendant environ 3 secondes. Placez immédiatement l’anneau sur une assiette tout en tenant l’anneau avec la pince pour éviter qu’il ne « saute ».
- Assurez-vous que l’anneau repose à plat contre la surface de la gélose en appuyant doucement avec la pince à plusieurs endroits de l’anneau. Lorsque vous placez l’anneau, veillez à laisser de la place pour trois anneaux supplémentaires.
- Faites fondre les trois anneaux de cuivre supplémentaires à la surface de la plaque en prenant soin de les placer le plus près possible les uns des autres afin qu’ils soient tous les quatre dans le champ de vision de la caméra.
REMARQUE : Faire une bonne étanchéité avec la gélose est essentiel pour garder les vers dans les anneaux pendant le dosage. Il est peu probable que les anneaux qui sautent sur la plaque fassent l’étanchéité correcte avec la gélose et peuvent marquer la gélose, ce qui permet aux vers de s’enfouir et interfère avec la visualisation des vers.
- Pour chaque plaque d’essai, préparez une plaque d'« acclimatation », qui doit être séchée et non ensemencée et ne recevra pas d’éthanol. Placez quatre anneaux de cuivre sur ces plaques.
- Étiquetez le bas des plaques à côté de chaque anneau avec la souche de vis sans fin à utiliser dans l’anneau, en prenant soin de ne pas écrire dans le champ de vision de l’anneau lui-même. Faites correspondre les étiquettes sur la plaque de dosage avec la plaque d’acclimatation qui l’accompagne.
- Calculer la quantité d’éthanol à 100 % à ajouter à chaque plaque d’essai de manière à ce que la concentration finale soit de 0 mM ou de 400 mM d’éthanol (rapport poids/volume). Pour chaque expérience (n = 1), il y aura une plaque d’éthanol de 0 mM et une plaque d’éthanol de 400 mM ; Les plaques d’acclimatation ne reçoivent pas d’éthanol. Ajoutez l’éthanol en le pipetant autour de la surface de la plaque. Utilisez un film de laboratoire pour sceller la plaque et lui permettre de s’équilibrer sur la paillasse pendant 2 heures.
- Lorsque 1,5 heure s’est écoulée, commencer l’étape d’acclimatation du test, étape 2.2.
- Effectuer un test de locomotion : Plaques d’essai
- Transférez soigneusement 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d’un anneau de cuivre sur la plaque d’acclimatation. Retirez tout aliment visible sur la gélose à ce stade en grattant doucement avec le cure-vers. Variez l’ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont placés sur les plaques d’un essai expérimental à l’autre, de sorte que les mêmes souches ne soient pas placées sur les plaques dans le même ordre d’un essai à l’autre.
REMARQUE : L’objectif est de transférer les animaux dans l’assiette avec des quantités minimales de nourriture, car si la nourriture sur la plaque d’acclimatation est transférée sur la plaque d’essai, les vers s’agrégeront autour de la nourriture et l’effet du médicament sur la locomotion sera obscurci.
- Veillez à ne pas casser la surface de la gélose avec la pioche, car cela permettrait aux vers de s’enfouir et perturberait le dosage. Incuber les vers à RT pendant 30 min.
- S’assurer qu’il y a un intervalle approprié entre les initiations de chaque plaque. Un expérimentateur expérimenté peut déplacer 40 animaux, 10/anneau pour 4 anneaux en < 1,5 min, mais n’importe quel intervalle jusqu’à 2 min est acceptable. Le test standard permet d’enregistrer des vidéos à 10-12 min et 30-32 min d’exposition pour 0 mM et 400 mM d’éthanol.
- Lancez la plaque d’acclimatation pour l’exposition à 0 mM et la plaque d’acclimatation pour l’exposition à 400 mM à environ 2 min et 30 s d’intervalle pour permettre l’enregistrement du premier fichier vidéo avant le début de la deuxième vidéo.
- Après la période d’acclimatation de 30 minutes, transférez les vers des plaques d’acclimatation aux plaques de dosage. Transférez les vers vers sur les plaques d’essai (0 mM ou 400 mM d’éthanol) dans le même ordre qu’ils ont été ajoutés à la plaque d’acclimatation, en gardant une trace du temps entre les complétions de chaque plaque. Scellez la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d’éthanol par vaporisation.
- Utilisez un mouvement de ramassage avec un pic à vis aplati à bords fins pour collecter les vers sur le dessus du pic aplati. Effectuez le transfert des vers de la plaque d’acclimatation non ensemencée à la plaque d’essai sans utiliser de bactéries, ce qui est couramment utilisé dans le transfert des vers car cela aide à coller le ver au pick.
REMARQUE : La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très importante, car les premiers vers sur la plaque seront exposés à l’éthanol plus longtemps que les derniers vers ajoutés à la plaque, et des points temporels plus précoces peuvent montrer des effets dépendants du temps. C’est la principale raison de la rotation des souches qui sont placées sur une plaque en premier sur les répétitions expérimentales.
- Effectuer un test de locomotion : Tournage
- Utilisez une combinaison microscope/caméra qui permet d’imager simultanément les quatre anneaux dans le champ de vision (environ 42 x 42 mm2 carrés), comme un objectif de microscope de 0,5x, un grossissement de 0,8x et une caméra avec un capteur CCD de 2048 x 2048 de 7,4 μm de pixels.
- Utilisez un éclairage uniforme sur l’ensemble du champ de vision, ce qui facilite la reconnaissance des objets au seuil d’intensité. Un rétroéclairage de 3 « x3 » fonctionne bien.
- Imagez les vers sur une plaque positionnée côté support vers le haut (couvercle vers le bas), ce qui génère un contraste perdu lors de l’utilisation du rétroéclairage par rapport à une source de lumière transmise par microscope traditionnelle.
- Préparez le logiciel d’analyse d’images pour capturer des vidéos en accéléré des vers en mouvement. Réglez le logiciel pour qu’il capture des images en niveaux de gris 12 bits toutes les 1 seconde, sous la forme d’une vidéo de 2 minutes (120 images). Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d’image suffisante, utilisez un mode de regroupement 2x2 pour capturer des images de 1024 x 1024 pixels.
- Enregistrez les films. Commencez l’enregistrement d’une vidéo de 120 images de la première plaque (0 mM d’éthanol) 10 min après que les dernières vis ont été placées sur cette plaque. Enregistrez le fichier vidéo.
- Enregistrez la deuxième plaque (400 mM d’éthanol). Répétez ce processus pour les deux plaques en commençant 30 minutes après que les dernières vers ont été placées sur la première plaque (0 mM d’éthanol) pour capturer les points de temps de 30 à 32 minutes pour chaque exposition.
REMARQUE : Prévoyez suffisamment de temps pour sauvegarder les fichiers d’image après chaque session de capture avant de commencer l’enregistrement de la plaque suivante à analyser.
- Pour assurer la pérennité des films archivés et permettre à ces films d’être ouverts et analysés par d’autres logiciels d’imagerie open source du domaine public, tels que ImageJ, convertissez une copie de chaque film en fichiers TIFF 8 bits 256 niveaux de gris.
REMARQUE : Le logiciel d’analyse d’images décrit ici utilise un format de fichier propriétaire.