Article de méthode

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

DOI :

10.3791/2021

20 juillet 2010

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l'enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Résumé

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Microscopie électronique à transmission (MET) est extrêmement utile pour la visualisation de la microglie, oligodendrogliome, astrocytaire, et neuronale compartiments subcellulaires (dendrites, épines dendritiques, axone, axone terminal, péricaryon), ainsi que leurs organites intracellulaires et du cytosquelette, dans le système nerveux central à haute résolution spatiale. Combiné avec la TEM, pré-enrobage immunocytochimie permet la discrimination des éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d'identification (par exemple, microgliales péricaryon et des processus, en utilisant un anticorps dirigé contre le marqueur spécifique à la microglie Iba1 (ionisé molécule adaptatrice une fixation du calcium; tel que présenté ici)), en identifiant le contenu neurotransmetteur des éléments cellulaires (par exemple, sérotoninergiques) et leur localisation ultrastructurale des protéines solubles ou membranaires (par exemple, 5 HT1A et EphA4 récepteurs). Ici, nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris avec l'acroléine fixateur, l'enlèvement et le sectionnement du cerveau, ainsi que l'immunoperoxydase-diaminobenzidine (DAB) coloration, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt immunocolorés pour examen avec le TEM. Lorsque rigoureusement exécutée, cette technique fournit un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques.

Protocole

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1. Perfusion des animaux

  1. Le jour avant la perfusion, préparer:
    - 2 L de tampon phosphate (PB; 100 mM, pH 7,4) et 1 L de sodium tampon phosphate salin (PBS, 0,9% de NaCl dans 50 mM de PB, pH 7,4) dans de l'eau bidistillée. Stocker le PBS et 1L de PB à 4 ° C. Ils seront utilisés pour la perfusion et de pré-enrobage immunocytochimie.
    - 1L de 4,0% paraformaldéhyde (PFA, pH 7,4) la solution de fixation, ce qui permettra à la perfusion de 6 souris. À cette fin, la chaleur jusqu'à 1 L de PB sous une hotte. Peser 40 g de paraformaldéhyde granulaire (PFA) et verser dans la solution PB quand elle atteint 60 ° C. Quand la solution est claire, av....

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Discussion

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Ici, nous avons décrit un protocole de préparation de tissu cérébral de souris pour immunoélectromicroscopie qui offre un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques, lorsque les procédures sont rigoureusement exécutée.

Combiné avec la TEM, cette méthode permet de distinguer les éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d'identification. En particulier, la coloration immunoperoxydase-DAB du Iba1 permet.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Nous remercions Shao-Ming Lu et Harris A. Gelbard pour l'utilisation d'une pompe péristaltique et vibratome, ainsi que Karen L. Bentley et Gayle Schneider au Core Facility microscope électronique à la recherche de l'Université de Rochester Medical Center de l'assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH (EY019277), Whitehall Fondation Burroughs Wellcome Fund et la Fondation Alfred P. Sloan pour AKM. M.-È.T. est financé par un Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) de bourses de formation postdoctorale.

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Matériaux

* On doit toujours travailler sous une hotte et porter des gants en nitrile lorsque vous manipulez l'acroléine, le paraformaldéhyde, et l'osmium et devrait également disposer de leurs déchets de façon appropriée.

Références

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  1. Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
  2. Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin ....

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Mots-clés

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