Préparation d’échantillons pour la métabolomique : méthode de préparation d’échantillons cellulaires pour le profilage de métabolites

Abstract

Source : Zhao, Y. C. et. al., Biologie des systèmes de régulation métabolique par la signalisation des récepteurs d’œstrogènes dans le cancer du sein. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit une technique de préparation d’échantillons de cellules cancéreuses du sein pour le profilage des métabolites. Les cellules cancéreuses du sein sont traitées avec de l’œstradiol, qui se lie au récepteur alpha des œstrogènes et provoque une modification de la composition des métabolites.

Protocol

1. Préparation d’échantillons de dosage métabolomique

1. Culture cellulaire et traitement
   1. Semez 400 000 cellules MCF7 par plaque de 10 cm dans un milieu de culture. Pour chaque traitement, préparez trois échantillons. Utilisez deux plaques dans chaque échantillon pour recevoir suffisamment de cellules pour la détection. Le jour 3, retirez le milieu et ajoutez 5 ml de milieu frais avec ou sans ^10-8 M d’œstradiol ou d’E2 dans les cellules. Traiter les cellules pendant 24 heures (37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂).
2. Prélèvement d’échantillons
   1. Ajoutez 5 ml de PBS glacé dans la plaque, aspirez le PBS après avoir brièvement incliné la plaque plusieurs fois. Répétez deux fois et retirez autant de PBS que possible après le dernier lavage.
   2. Ajoutez 750 μl d’acétone pré-froide dans chaque plaque et grattez les cellules. Mélangez les cellules d’acétone de deux plaques dans un tube de 2 ml sur de la glace.
   3. Comptage cellulaire pour la normalisation
      1. Pour chaque traitement, utilisez deux plaques supplémentaires pour la quantification cellulaire. Pour détacher les cellules de la plaque, ajoutez 2 ml de tampon HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075 % de NaHCO₃ et 1 mM d’EDTA) dans chaque plaque et incubez pendant 5 min.
      2. Collectez et mélangez bien les cellules en pipetant les cellules dans le tampon HE. Utilisez une solution cellulaire totale de 20 μl pour compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
3. Stocker les échantillons à -80 °C avant de les envoyer au centre de métabolomique pour identifier et quantifier les métabolites à l’aide de l’analyse par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC-MS).