Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis</em

Résumé

La grenouille Xenopus laevis Fournit une intéressante alternative non-mammifère modèle pour explorer la capacité de la protéine de choc thermique tels que gp96 à promouvoir spécifiques de l'antigène des cellules T CD8. Nous présentons des méthodes pour étudier In vivo des présentation croisée d'antigènes tumoraux par la peau et gp96.

Résumé

Nous avons développé dans le Xenopus laevis amphibiens unique non mammifères modèle pour étudier la capacité de certaines protéines de choc thermique (HSP), tels que gp96 pour faciliter la présentation croisée des antigènes chaperonné et susciter innée et adaptative réponses des lymphocytes T. Rejet de greffe de peau de Xenopus fournit une excellente plateforme pour étudier la capacité de gp96 à susciter classiques du CMH de classe Ia (classe Ia) restreint les réponses des cellules T. De plus, le système modèle Xénope fournit également une alternative intéressante à la souris pour explorer la capacité de gp96 à générer des réponses contre les tumeurs qui ont régulé à la baisse de leurs molécules de classe Ia échappant ainsi à la surveillance immunitaire. Récemment, nous avons développé une méthode de criblage cellulaire adoptive de transfert en utilisant des clones de Xenopus leucocytes péritonéale comme des cellules présentatrices d'antigène (CPA), et montré que gp96 peut Premier réponses des lymphocytes T CD8 in vivo contre des antigènes mineurs d'histocompatibilité de peau ainsi que contre la tumeur du thymus Xenopus 15 / 0 qui n'exprime pas les molécules Ia classe. Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour effectuer ces tests, y compris le transfert d'élicitation, pulsant et adoptive de leucocytes péritonéale, ainsi que la greffe de peau et des essais de transplantation de tumeurs. De plus nous sommes également décrit la récolte et la séparation des leucocytes du sang périphérique utilisé pour la cytométrie de flux et de tests de prolifération qui permettent une caractérisation plus poussée des populations effectrices impliquées dans le rejet de la peau et des réponses antitumorales.

Protocole

1. Animaux

X. laevis x X. Gilli hybrides LG-6 et LG-15 clones isogenetic ¹ sont de notre colonie de reproduction à l'Université de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG et LG-6-15 partagent le même haplotype CMH hétérozygote (A / C) mais diffèrent au mineur d'histocompatibilité (H) loci. La descendance de ces clones sont produits par gynogenèse, dans lequel les œufs diploïdes produites par la femelle sont activés par les UV-irradiés sperme (aucune contribution d'ADN pour la descendance).

L'utilisation de gants est facultatif. Certaines personnes préfèrent ne pas les porter parce qu'il est plus difficile à manipuler les grenouilles (glissante) et en fait il semble rendre les grenouilles inconfortable.

2. Purification de gp96 du 15 / 0 tumorale (tumeur exprime à la fois et Minor H-Ags)

Gp96 purification a été décrit précédemment ^{2, 3.} En bref, gp96 est purifiée par fractionnement au sulfate d'ammonium à 50-70%, suivie par conA-sépharose et DEAE chromatographie. Environ 20-50 mg de protéine peut être obtenue par 1 ml de tissu tumoral. Pureté de la préparation est déterminé par SDS-PAGE et coloration ruban.

3. Élicitation et la récolte des leucocytes péritonéale (PL) de mineurs H-Ag-disparates LG-6 Grenouilles

1. Cultiver une nuit de 25 ml E. La culture Coli dans un tube conique de 50 ml à 37 ° C avec agitation.
2. Le jour suivant, la chaleur tue les bactéries en la faisant bouillir pendant 1 heure.
3. Centrifuger la chaleur a tué E. Coli pendant 15 min à 2000 rpm (1500 g) à 4 ° C.
4. Retirer le surnageant et remettre le culot bactérien en 1 / 10 ^ème du volume de culture d'origine (2,5 ml) dans APBS. A ce point la culture bactérienne est prêt à être utilisé et doit être utilisé dans les 24 heures.
5. Injecter par voie intrapéritonéale (IP) 200 (pour une grenouille 2 pouces) ou 300 ul (pour une grenouille 3 pouces) de l'tuées par la chaleur préparation bactérienne par grenouille en utilisant une jauge de 25 5 / 8 aiguille.
6. Trois jours après l'injection PL sont récoltés par lavage intrapéritonéale.
7. Avant la récolte PL, les grenouilles adultes sont anesthésiés par immersion dans une solution aqueuse à 0,1% du méthane sulfonate tricaïne (TMS, MS-222) tamponnée avec du bicarbonate de sodium pour 5 min jusqu'à ce que tout mouvement cesse (la durée dépend de la taille et l'âge). Animaux réveille dans les 10-20 min après le traitement.
8. Désinfecter l'abdomen de la grenouille avec une petite quantité d'éthanol à 70%.
9. Injecter 5 ml (pour une grenouille 2 po) ou 10 ml (pour une grenouille 3 pouces) de APBS stériles pré-chauffé à température ambiante dans la cavité péritonéale à l'aide d'une jauge 18 1 ½ aiguille. Retirez l'aiguille et masser doucement la grenouille pendant une minute pour s'assurer que le tampon injecté s'équilibre avec le liquide dans la cavité du corps.
10. Utilisez un nouveau calibre 18 1 ½ aiguille sans seringue pour recueillir le liquide péritonéal qui va goutte à goutte de l'arrière de l'aiguille dans un récipient propre de 50 ml tube conique. Assurez-vous de récupérer autant du volume initial injecté que possible. Soyez prudent pour éviter les vaisseaux sanguins dans la zone centrale de la région abdominale.
11. Une fois que les MDD sont récoltées mettre la grenouille dans un récipient avec de l'eau peu profonde jusqu'à ce qu'il soit éveillé à quel point il peut être remis dans sa cage.

4. Transfert adoptif de pulsation et de Lg-6 Pls Into Naïve Lg-6 récipiendaires

1. Lavez le PLS fois avec APBS froide et les centrifuger à 1000 rpm (750 g) pendant 10 min à 4 ° C.
2. Retirer le surnageant et remettre le PLS dans APBS.
3. Impulsion du PLS avec gp96 à une concentration de 1 ug gp96 par 5 x 10 ⁵ MDD.
4. Une fois que la quantité appropriée de gp96 est ajouté à la PLS, les mélanger par pipetage et incuber sur de la glace pendant 1 heure.
5. Centrifuger les cellules soit à 1000 rpm pendant 10 min à 4 ° C ou à 14 000 rpm pendant 1 min pour éliminer toute Unbound gp96.
6. Lavez le PLS 3X avec APBS froide pour s'assurer qu'il n'ya pas résiduelle gp96 gauche.
7. Resuspendre le PLS pulsé à une concentration de 5 x 10 ⁵ PL par 300 ul.
8. Adoptive transfert de PL par injection ip à l'aide de calibre 25 5 / 8 aiguille. Injecter 300 ul des MDD pulsé (5 x 10 ⁵ cellules) par animal.
9. Les grenouilles ont besoin d'être amorcée au moins 3 jours avant de continuer avec greffe de peau ou des expériences défi tumeur.

5. Assay Skin Graft

Rejet de greffe de peau est un test bien établi chez Xenopus ^{4, 5, 6.} Chez le xénope, un destinataire rejette la peau des bailleurs de fonds affichant 1 ou 2 inadéquation haplotype CMH au sein de 18-22 jours à 21-22 ° C. En revanche, les greffes de peau entre LG et LG-6-15 clones qui ne diffèrent que par un mineur H-Ags sont rejetés plus lentement (plus que 30 jours). Toutefois, ce rejet est accéléré chez les receveurs de that ont été amorcées contre les donneurs mineurs H-Ags soit par une greffe de peau précédentes ou par immunisation avec gp96 purifiée à partir du donneur. Pas de rejet à tout produit lorsque le donneur et le receveur sont génétiquement identiques (par exemple, les animaux clonés ou totalement consanguins). Par conséquent, cette technique simple est très puissante pour caractériser in vivo les réponses immunitaires induites par gp96.

1. Anesthetize grenouille donateurs comme décrit dans 3.7.
   Remarque: Seul un minimum de précautions doivent être prises depuis Xenopus produire de puissants peptides anti-microbiens (par exemple, magainine) dans la peau qui évite la nécessité d'asepsie totale. En fait, le traitement de la grenouille avec un désinfectant serait néfaste pour la peau. En outre, les Xenopus n'ont pas de pathogènes qui peuvent être transférées aux humains. Par conséquent, l'utilisation de gants est facultatif. Cependant, tous les instruments de dissection utilisés doivent être autoclavés et toutes les solutions doivent être stériles.
2. Couper et enlever une petite (20 mm x 5 mm) morceau de peau ventrale (peau de l'abdomen qui apparaît argenté dû à la présence de cellules pigmentées irridophore) d'une grenouille donateurs LG-15 à l'aide des ciseaux.
3. Placez la peau dans un APBS PetriDish contenant et le garder sur la glace. Manipuler les tissus de la peau très doucement, éviter le tenant entre les deux pinces.
4. En utilisant une lame de rasoir ou des ciseaux couper greffes individuelles en morceaux de 5 mm x 5 mm. Gardez les fragments dans APBS sur la glace.
5. À ce stade de la grenouille donneur est placée dans un récipient avec de l'eau peu profonde jusqu'à ce qu'il soit éveillé et il est alors placé dans de l'eau contenant des antibiotiques (Penstrep à une concentration de 5 mg / L). La grenouille est conservé dans de l'eau avec des antibiotiques pendant deux jours à quel point il est retourné dans l'eau normale. La petite plaie à l'endroit où la peau a été retirée n'a pas besoin d'être cousu et guérit en une semaine.
6. Anesthetize le destinataire LG-6 grenouille.
7. Faire une petite incision sur la dorsale (dos) la peau du destinataire et de l'insertion du greffon 5 mm x 5 mm sous la peau avec le côté argenté en place. Soyez prudent de ne pas introduire grosses bulles d'air sous la peau car cela peut conduire à des déplacements ou même la perte du greffon.
8. Assurez-vous noter les inscriptions à ciseaux et des pinces sur les greffons, car ceux qui ne sont pas comptés comme un rejet du greffon une fois que la notation commence.
9. 24 heures plus tard une partie de la peau de l'hôte superposant doit être retiré de la greffe.
10. Anesthetize le destinataire LG-6 grenouille. Manipuler l'animal tel que décrit en 5.1.
11. Avec des ciseaux autoclavé découper une fenêtre autour de la greffe de sorte que la greffe peut être librement visualisées. Soyez prudent de ne pas toucher la peau donateur ou à provoquer le saignement. Laissez la grenouille de récupérer comme décrit en 5.5.
12. Commencer à marquer la greffe d'emblée en prenant un croquis. Rejet de greffe de la peau est déterminée par le pour cent de la destruction de la irridophores sur la peau greffée.
13. Les greffons doivent être vérifiés tous les 2-3 jours, mais les animaux n'ont pas besoin d'être anesthésié pour cela. Pour visualiser les greffes, les grenouilles ont besoin d'être placé dans un PetriDish sous un microscope à dissection.

6. Whole-Mont Immunohistologie du peau transplantée

Grenouille toute monture immunohistologie a été décrit précédemment ^6. En bref, la grenouille est anesthésié et placé sous le microscope sur une serviette en papier stériles pré-mouillée avec de l'eau grenouille (la zone de travail est également de manière aseptique). La peau est ensuite transplanté récolté avec une petite quantité de peau environnante hôte et il est coloré avec des anticorps similaire à coloration des cellules pour l'analyse de cytométrie en flux ^6. Instruments à l'autoclave et tampons stériles doivent être utilisés. Après coloration de la peau est placée sur une lame de microscope et délicatement pressé avec une lamelle. À ce stade de la peau peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence pour les différentes populations de cellules qui ont infiltré la greffe. Après la procédure de la grenouille est conservé dans de l'eau avec des antibiotiques tels que décrits dans la section 5.5. et est retourné dans l'eau normale. La petite blessure à gauche où la peau a été enlevée guérit en une semaine.

7. Caractérisation des leucocytes du sang

1. Avant de retirer le sang de la grenouille, on a besoin pour préparer des «aiguilles de verre" en tirant stériles Pipettes Pasteur au cours de la flamme. L'extrémité de la pipette fines est aiguisée sous la loupe binoculaire. La pipette est alors relié à un tube en plastique d'aspiration.
   Tous les instruments tels que les pinces et de ciseaux doivent être autoclavés avant usage.
2. Préparez aussi glacée 10 ml de solution d'héparine APBS et en ajoutant 50 unités d'héparine par 1 mL d'APBS. Conserver la solution sur la glace. Toutes les solutions utilisées doivent être stériles.
3. Anesthetize grenouille comme décrit dans 3.7, et suivez les mêmes procédures de manipulation des animaux tels que décrits au paragraphe 5.1. .
4. Coupez la peau au-dessus des pieds postérieurs à exposerla veine dorsale du tarse.
5. Remplir la pipette Pasteur avec 1-2 ml de solution d'héparine APBS +.
6. Insérez le «aiguille de verre" dans la veine et commencer à recueillir le sang par aspiration lentement avec la bouche. Il est important d'avoir APBS solution + héparine dans le «aiguille de verre" car cela éviter la coagulation du sang et de colmatage de la pointe de l'aiguille.
7. 1 à 2 mL de sang peuvent être obtenues d'une grenouille de taille moyenne.
8. La petite incision sur la jambe de la grenouille n'a pas besoin d'être cousu et la blessure guérit en une semaine.
9. Centrifuger le sang à 1000 rpm pendant 10 min à 4 ° C.
10. Enlever le surnageant et laver les cellules 1X avec 10 mL d'APBS froid.
11. Recouvrir avec 2 ml de sang (1-5 x 10 ⁶ cellules) sur 1 ml de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) préchauffé à la température ambiante afin de séparer les leucocytes du sang à partir des cellules rouges du sang.
12. Centrifuger 20 min à 1000 rpm à température ambiante, sans frein, et recueillir ensuite la bande des leucocytes.
13. Laver les cellules 2X avec APBS par centrifugation à 1400 rpm pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer l'ficoll résiduelle.
14. À ce stade, les cellules sont prêtes à être colorées avec des anticorps pour l'analyse de cytométrie en flux, ou pour être utiliser pour des essais en culture in vitro.

8. Tumeur Assay transplantation

1. Environ une semaine avant le dégel expérimentation sur un nouveau lot de cellules 15 / 0 de la tumeur et de s'assurer que les cellules commencent à se développer ainsi. Le milieu de culture est succinctement décrite dans la section suivante et de façon plus détaillée dans ^3.
2. Développer les cellules 15 / 0 tumeur.
3. Le jour de l'expérience, un comptage des cellules et détermine la mort cellulaire par exclusion du bleu trypan. La mort cellulaire doit être inférieure à 5%. Laver les cellules 1X dans APBS froid, et centrifuger à 1000 rpm à 4 ° C pendant 10 min.
4. Resuspendre les cellules tumorales dans le milieu de culture à une densité de 5 x 10 ⁵ 15 / 0 300 cellules par mL.
5. Transplant 5 x 10 ⁵ cellules dans 300 ul par volume de grenouille par injection sous-cutanée à l'aide d'une jauge 25 5 / 8 aiguille sur un côté de la dorsale (dos) côté de l'animal.
6. La croissance tumorale commencera dans les 2-3 semaines après l'épreuve tumeur. L'apparition de la tumeur primitive doit être noté et le volume de la tumeur a besoin d'être enregistrés tous les 2-3 jours. Le volume des tumeurs (hauteur x longueur x largeur) est mesurée à l'aide des étriers.
7. Une fois que la tumeur se développe à 3.500 mm ³ ou la grenouille commence à chercher léthargique, il doit être euthanasié pour éviter la gêne.

9. Réactifs nécessaires:

• Amphibian tampon phosphate salin (APBS): 6,6 g / L de NaCl, 1,15 g / L de Na ₂ HPO _4, 0,2 g / L KH ₂ PO. pH à 7,5 à l'aide de NaOH 10N et stérilisé par filtration à travers filtre de 0,2 um.
• Méthanesulfonate de tricaïne (TMS, MS-222) (Croissant recherche CAS # 886-86-2 produits chimiques).
• Le bicarbonate de sodium (Fisher Scientific S-233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml)
• Sel de sodium d'héparine (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Milieu de culture pour Xenopus 15 / 0 tumeurs [voir 3 pour plus de détails]: 1 L de milieu DMEM Iscove basale (Gibco Invitrogen-11965) avec 10 mL d'insuline, 10 ml non acides aminés essentiels, 10 ml de pénicilline-streptomycine; 10 ug / ml de kanamycine; 3 mL de Primatone (Sheffield Products Division), 1 mL de β2-mercaptoéthanol et 3,02 g de NaHCO ₃ dans l'eau (pH 7,0). Ce milieu est dilué à l'osmolarité des amphibiens en ajoutant 30% d'eau bidistillée, et supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, superantant 20% d'une A6 reins Xenopus lignée cellulaire, et 0,25% de la normale Xenopus sérum.

10. Les résultats représentatifs

Figure 1. Stéréomicroscopique analyse du rejet de greffe de peau 12 jours après la transplantation. LG-6 grenouille clonée a reçu une greffe de peau provenant soit (A) un MHC-identiques LG-6 (ne montre aucun rejet) ou (B) d'un donneur MHC-disparates consanguine (80% de rejet). Les flèches montrent des cellules pigmentées iridophore argentée marquage en bonne santé (non-rejet) greffé des tissus. (*) Marque de pince pas due à un rejet.

Figure 2. Gp96 facilite la présentation croisée d'antigènes tumoraux chez le Xénope. LG PL-15 (5 x 10 ⁵⁾ ont été puisées pendant 1 h sur la glace, soit avec APBS (contrôle négatif), 1 ug de recombinaison gp96 purifié à partir d'un E. G la culture Coli, ou 1 ou 0.5 de gp96 purifiée à partir de 15 / 0 tissu tumoral. Après 3 lavages, les cellules ont été transférées dans adoptive receveurs adultes LG-15 (1 x 10 ⁶ / personne). Trois jours plus tard, en direct 15 / 0 cellules tumorales (5 x 10 ⁵⁾ ont ététransplantés par injection sous-cutanée. Chaque courbe représente la cinétique de croissance tumorale chez une grenouille. Défi jours après lorsque les tumeurs ont été suivis première apparition, et la taille des tumeurs a été déterminé périodiquement avec un (longueur x largeur x épaisseur) étrier.

Discussion

Les amphibiens Xenopus est unique polyvalent non mammifères modèle pour étudier l'immunité. Son utilisation intensive dans la recherche biomédicale et immunologiques a donné de nombreux outils de recherche importants tels que les clones CMH définies LG et LG-6-15 ainsi que différentes lignées de cellules et d'anticorps monoclonaux. Grâce à ces outils, nous avons établi différentes in vitro et in vivo pour étudier la capacité des protéines de choc thermique tels que gp96 de médiation pu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs nécessaires :
Solution saline tamponnée au phosphate pour amphibiens (APBS) :
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
NaOH 10 N
Tricaine méthanesulfonate (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS n° 886-86-2
Bicarbonate de sodium	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Héparine, sel sodique	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Milieu de culture pour les tumeurs Xenopus 15/0 [voir 3 pour plus de détails] :
Milieu basal Iscove DMEM	GIBCO, par Life Technologies	11965
Insuline
Acides aminés non essentiels
Pénicilline-streptomycine
Kanamycine
Primatone	Division des produits Sheffield
β2-mercaptoéthanol–éthanol
NaHCO3
30 % d'eau distillée doublement
5 % de sérum de veau fœtal
20 % de surnageant provenant d'une lignée cellulaire de rein de Xenopus, A6
0,25 % de sérum Xenopus normal
Matériaux et équipement :
Tubes coniques de centrifugation de 50 et 15 ml (stériles)
Aiguilles stériles Precision Glide, jauge 25, 5/8 pouce	BD Biosciences
18 gauge 1½ Aiguilles stériles Precision Glide	BD Biosciences
Seringue stérile de 1 ml à embout lisse pour tuberculine	BD Biosciences
Seringue stérile de 10 ml à embout lisse	BD Biosciences
Tubes microcentrifuge de 1,5 ml (stériles)
Plaques de Petri en polystyrène 60 x 15 mm, stériles	Falcon BD
Lames de rasoir
Lames à microscope Premium 25 x 75 mm x 1 mm	Fisher Scientific
Plaques de Pétri en verre de 10 cm
9" Pipettes Pasteur en verre borosilicaté Durex, jetables, avec embout en coton	VWR international
Tuyau Tygon
Deux bijoutiers suisses n° 5’S Forceps	Miltex Inc.
Microciseaux à ressort McPherson-Vannas, bord droit, 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
pieds à coulisse Helios
Microscope stéréoscopique
Illuminateur à haute intensité
Hémacytomètre
Un bec Bunsen
37°incubateur agitateur
Centrifuger