Article de méthode
L'ADN des isotopes stables de sondage est une méthode de culture-indépendante pour identifier et caractériser des communautés actives de microorganismes qui sont capables d'utiliser des substrats spécifiques. L'assimilation de substrat enrichi en isotope lourd conduit à l'incorporation des atomes marqués dans la biomasse microbienne. Ultracentrifugation en gradient de densité récupère l'ADN marqué en aval des analyses moléculaires.
L'ADN des isotopes stables de sondage (DNA-SIP) est une technique puissante pour identifier les microorganismes actifs qui assimilent substrats carbonés particulier et des nutriments dans la biomasse cellulaire. Comme telle, cette technique de culture-indépendante a été une méthode importante pour assigner la fonction métabolique avec les diverses communautés vivant dans un large éventail de milieux terrestres et aquatiques. Suite à l'incubation d'un échantillon de l'environnement avec des isotopes stables des composés marqués, extraits d'acides nucléiques est soumis à une ultracentrifugation en gradient de densité et de fractionnement du gradient subséquente de séparer les acides nucléiques de densités différentes. Purification de l'ADN à partir de chlorure de césium récupère étiquetés et non étiquetés d'ADN pour la caractérisation moléculaire ultérieure (par exemple les empreintes digitales, les puces, les bibliothèques clone, métagénomique). Ce protocole fournit la vidéo JoVE visuelle étape par étape, des explications sur le protocole d'ultracentrifugation en gradient de densité de fractionnement du gradient, et la récupération d'ADN marqué. Le protocole comprend également des échantillons de données SIP et met en évidence d'importants conseils et avertissements qui doivent être considérées pour assurer un succès DNA-SIP analyse.
1. Préparation des réactifs
DNA-SIP nécessite l'utilisation de réactifs qui doivent être préparés à l'avance de la procédure actuelle. Les orientations pour la préparation de chaque réactif sont répertoriés dans cette section et sont modifiées à partir d'un précédent protocole SIP 1.
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Une bonne conception des isotopes stables expériences de sondage est d'une importance critique pour l'obtention de l'ADN marqué au-dessus de la communauté de fond non étiquetés. Considérations relatives à l'échantillon des durées d'incubation, les concentrations de substrat, les conditions d'incubation (par exemple, les nutriments, l'humidité du sol), cross-alimentation et de reproduction ont été discutées ailleurs 10,18 et nous recommandons au lecteur de consulter ces publications.......
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Ce travail a été soutenu par le projet stratégique et subventions à la découverte de JDN en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Bromophénol bleu | Réactif | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Chlorure de césium | Réactif | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Éthanol, qualité réactif | Réactif | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Bromure d'éthidium | Réactif | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Acide chlorhydrique | Réactif | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Polyacrylamide linéaire | Réactif | Applichem | A6587 | |
| Polyéthylène glycol 6000 | Réactif | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Chlorure de potassium | Réactif | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Chlorure de sodium | Réactif | Fisher Scientific | S2711 | |
| Perles d'hydroxyde de sodium | Réactif | Fisher Scientific | S3181 | |
| Base Tris | Réactif | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Équipement | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifugeuse | Équipement | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Équipement | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Pompe à perfusion | Équipement | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Numéro de modèle : BSP Voir www.braintreesci.com pour les détails de commande. |
| Scelleur de tubes | Équipement | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifugeuse | Équipement | Beckman Coulter Inc. | ||
| Rotor d'ultracentrifugeuse | Équipement | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Source de lumière ultraviolette | Équipement | UVP Inc. | 95-0017-09 | Toute source UV convient |
| Écran facial pour lumière ultraviolette | Équipement | Fisher Scientific | 114051C | |
| Bouchons en caoutchouc butyle, gris | Matériau | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Tubes de centrifugation | Matériau | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Aiguille hypodermique, calibre 23, longueur 2” | Matériau | BD Biosciences | 305145 | |
| Tubes microfuge, 1,5 mL | Matériau | DiaMed | AD151-N500 | |
| Joints centraux ouverts, diamètre 20 mm | Matériau | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pipettes Pasteur, en verre | Matériau | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pointes de pipette | Matériau | DiaMed | BPS340-1000 | Le numéro de catalogue correspond à des pointes de 200 μl. Des pointes de 10 ou 20 μl peuvent être achetées auprès de la même source |
| Tuyau de pompe, alésage 1,5 mm x paroi 1,5 mm | Matériau | Appleton Woods | ||
| Tubes à vis, 15 mL | Matériau | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Flacons de sérum, volume 125 mL | Matériau | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Seringue, 60 mL | Matériau | BD Biosciences | 309653 |
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